高原小哺乳动物应激激素CRF家族的克隆和功能比较

【作者】 陈学群； 杨甲芳； 石艳军； 马志强； 陈晓澄； 边疆晖； 于鸿浩； 杜继曾；

【机构】 浙江大学基础医学院神经生物学和生理学研究室； 浙江大学基础医学院卫生部医学神经生物学重点实验室； 中国科学院西北高原生物所生态研究室； 中国科学院西北高原生物所标本馆；

【摘要】 研究以高原小哺乳动物——高原鼢鼠(Myospalax Baileyi)和甘肃鼢鼠(Myospalax Cansus)及根田鼠为对象,克隆了其的CRF、Ucn和CRFR1基因编码区CDS,比较其序列差异,以及大脑皮层mRNA表达水平及HPA轴反应性,进一步研究了垂体CRFR1受体的低氧应激转录机制。这两种鼢鼠的CRF成熟肽与大鼠、小鼠、高原鼠兔和人的氨基酸序列完全一致;Ucn成熟肽与大鼠和小鼠的完全一致,与人类相比,两种鼢鼠都有第2位和第4位的2个氨基酸变异(N-D,S-P),但高原动物——根田鼠和这两个动物相比较,根田鼠在第1位、第37位和第38位有3个氨基酸不同(D-N,F-L,D-H)。关于CRFR.1型受体,他的前体蛋白在已知序列的哺乳动物中同源性大于92%,和与人类相比,这两种鼢鼠分别有10和12个氨基酸位点的不同;而这两种动物相比,在第71位和第379位有2个氨基酸不同(F-L,H-R)。由于这两种动物CRF和UCN的氨基酸序列完全一致,所以CRFR1序列的变异可能是导致配体和受体亲和力,受体其他特性改变及HPA轴功能差异的基础,其HPA轴反应性从低到高依次为高原鼠兔,根田鼠,高原鼢鼠及实验室SD大鼠。高原鼢鼠大脑前额叶皮层CRF和CRFR1基因表达水平都高于甘肃鼢鼠;同时低氧(7000 m,8h)应激显著上调实验室SD大鼠大脑前额叶皮层的CRF、Ucn及CRFR1 mRNA表达。在表达CRFR1的AtT-20垂体细胞中,常氧下CRF显著降低CRFR1 mRNA的表达,AP-1拮抗剂可以阻断CRF诱导的CRFR1 mRNA表达的下降,NF-kB拮抗剂不能阻断CRF诱导的CRFR1 mRNA表达的下降;低氧(1%O2,24h)暴露后,CRF进一步升高CRFR1mRNA的表达,AP-1拮抗剂不能阻断CRF诱导的CRFR1 mRNA表达的上升,但NF-kB拮抗剂可以阻断CRF诱导的CRFR1 mRNA表达的上升,提示转录因子N1F-kB和AP-1参与低氧对CRFR1受体的转录。ChIP-PCR证明小鼠CRFR1受体启动子上分别存在5个AP-1和8个NF-kB结合位点。另外,利用定点突变和双荧光素酶报告技术证明转录因子HIF-1alph也参与低氧下垂体CRFR1型受体的转录调节。更多还原