小鼠SOCS1基因沉默重组慢病毒载体的构建及其在DC2.4细胞中的表达

【作者】 王琼； 刘维达； 史冬梅；

【机构】 中国医学科学院皮肤病研究所； 济宁市第一人民医院皮肤科；

【摘要】 目的:构建携带小鼠SOCS1基因沉默重组慢病毒载体,鉴定其在小鼠树突状细胞系(DC2.4)中SOCS1基因的表达并筛选稳定沉默表达SOCS1基因的小鼠树突状细胞系。方法:设计并合成SOCS1基因,连接表达载体pYr-Lvsh,连接产物转化感受态DH5α细胞后,挑克隆进行酶切及测序鉴定。将鉴定正确的载体转染293FT细胞,进行慢病毒包装及滴度测定。并将包装好的慢病毒PLV-musSOCS1-shRNA转染DC2.4细胞,通过荧光显微镜、流式细胞仪及real-time PCR检测DC2.4细胞中SOCS1基因的表达。台盼蓝染色检测转染后细胞活性。结果:将表达载体pYr-Lvsh送测序鉴定,结果显示引物完全连接到载体上。将获得的重组质粒用XhoI进行酶切鉴定,结果切下约2000bp的小片段。将测序所得的序列与设计的引物进行比对,结果符合预期,PLV-musSOCS1-sh构建成功。扩增后检测慢病毒滴度约为4×109 TU/ml。慢病毒转染细胞24h后,荧光显微镜下即可见少量表达绿色荧光成功转染的DC2.4细胞,随着时间的延长,转染成功的细胞逐渐增多且细胞内荧光强度渐次增强,48h后表达量明显增多,72h后更加明显。经流式细胞检测,48h及72h细胞绿色荧光表达率均可达到100%。对照组的细胞活性为(92.27±0.80)%;转染后48h的细胞活性为(88.40±0.92)%,与对照组比较细胞死亡率增加,差异有统计学意义(t=5.499,P=0.005);转染后72h的细胞活性明显降低,为(44.97±3.70)%,较对照组与48h转染组,差异有统计学意义(t=21.637,P=0.000;t=19.733,P=0.000)。real-time PCR检测,可见转染组SOCS1基因表达,明显低于空病毒载体对照组DC2.4细胞中SOCS1基因表达,下调约75.3%(t=-10.179,P=0.001)。结论:构建的慢病毒PLV-musSOCS1-shRNA在DC2.4细胞中成功沉默SOCS1基因,并稳定表达,成功筛选出低表达SOCS1的小鼠树突状细胞。为进一步通过SOCS1基因沉默调控DC免疫状态抗真菌感染免疫等相关研究奠定了基础。更多还原