小鼠2-细胞胚胎玻璃化冷冻及批量冻存技术研究

【作者】 李伟； 魏强； 赵晓娥； 马保华；

【机构】 西北农林科技大学动物医学院农业部动物生物技术重点实验室；

【摘要】 随着玻璃化冷冻技术的不断进步,玻璃化冷冻保存哺乳动物胚胎的效率越来越高。然而,现有的玻璃化冷冻技术在保存哺乳动物早期胚胎时仍然存在很多问题,如冷冻效率不高,潜在的冷冻损伤等。本研究采用尼龙网玻璃化冷冻方法,探索在尼龙网冷冻载体上批量化冻存小鼠2-细胞胚胎样本,使每片尼龙网上冷冻保存的小鼠2-细胞胚胎达到100枚左右,以满足小鼠胚胎空间发育研究对胚胎样本的批量需求。研究进一步采用密闭培养体系(地面模拟空间胚胎发育试验的培养条件)进行了批量化冷冻保存的小鼠2-细胞胚胎解冻后发育能力检测并进行了冷冻-解冻胚胎细胞膜完整性、细胞骨架、线粒体分布、水通道蛋白表达与分布等胚胎冷冻损伤研究,研究同时探讨了导致玻璃化冷冻小鼠2-细胞胚胎体外发育率降低的可能原因。1.玻璃化冷冻-解冻的小鼠2-细胞胚胎的体外发育研究采用尼龙网玻璃化冷冻法,以含有冷冻保护剂乙二醇(ethylene glycol,EG)、聚蔗糖(ficoll 70)和蔗糖(sucrose)的EFS20(EG20%,V/V)和EFS40(EG40%,V/V)作为玻璃化冷冻保护液,小鼠2-细胞胚胎在玻璃化冷冻保护液中处理后,迅速加载到尼龙网上,然后浸没于装有液氮的冻存管中,置于液氮罐中冻存,每片尼龙网上加载约100枚胚胎。解冻后小鼠2-细胞存活率为96.22±2.74%(1791/1857),其中完整胚胎(Intact Embryos,IEs)约占89.88±4.32%(1669/1857),部分完整胚胎(Partial Embryos,PEs)约占6.57±3.44%(122/1857)。因此,本研究采用的玻璃化冷冻方法可以用于批量冻存并获得批量存活的小鼠2-细胞阶段冷冻胚胎。小鼠2-细胞胚胎解冻后,将存活胚胎在常规微滴条件和密闭培养条件下体外培养72 h、96 h,结果表明,玻璃化冷冻的小鼠2-细胞胚胎能够在密闭培养条件下正常发育到囊胚阶段,并且发育能力正常,因此我们认为批量冷冻的胚胎小鼠早期卵裂胚胎能够满足空间胚胎发育试验要求。2.尼龙网法玻璃化冷冻小鼠2-细胞胚胎的冷冻损伤研究尼龙网法玻璃化冷冻过程中对2-细胞胚胎造成潜在损伤的研究结果显示,玻璃化冷冻的小鼠2-细胞胚胎细胞膜完整,微丝骨架发生了变化,但随着胚胎发育进行,微丝骨架分布逐步恢复;纺锤体没有发现变化,与新鲜胚胎中的纺锤体形态结构一致。解冻后胚胎中线粒体分布发生变化,在胚胎细胞质中散乱分布,呈现无规则聚集状态,而正常胚胎中,线粒体均匀分布在细胞质中,在细胞核周围呈现环绕聚集。从这些结果,我们认为,玻璃化冷冻可能导致部分线粒体分布异常,线粒体分布异常可能是导致胚胎发育率降低的原因。3.玻璃化冷冻对小鼠2-细胞胚胎AQP3和AQP7的影响为了进一步探讨玻璃化冷冻是否造成小鼠2-细胞胚胎水通道蛋白(aquaporin,AQP)表达变化。本研究检测了小鼠2-细胞胚胎玻璃化冷冻前后水通道蛋白3(aquaporin3,AQP3)和水通道蛋白7(aquaporin7,AQP7)在胚胎细胞的表达与分布。RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)检测结果显示,小鼠2-细胞胚胎玻璃化冷冻前后均表达AQP3和AQP7基因。qRT-PCR(quantitative real time polymerase chain reaction)检测结果显示,玻璃化冷冻-解冻的小鼠2-细胞胚胎中AQP3 mRNA和AQP7 mRNA相对表达量与新鲜2-细胞胚胎的表达量之间没有显著性差异(P<0.05)。蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测结果也验证了上述结果,这两种水通道蛋白的蛋白质表达水平未受到玻璃化冷冻-解冻的影响。免疫荧光检测结果显示,玻璃化冷冻前后小鼠胚胎AOP3蛋白分布情况一致,主要分布于细胞质、细胞膜、核膜;AQP7蛋白主要分布在细胞质、细胞膜,玻璃化冷冻前后AQP7的分布未发生明显变化。说明,玻璃化冷冻未明显影响小鼠2-细胞胚胎中AQP3与AQP7的表达与分布。更多还原