芸薹黄化病毒含有GFP标记基因侵染性cDNA克隆的构建

【作者】 陈清华； 赵添羽； 张晓燕； 王颖； 张宗英； 李大伟； 于嘉林； 韩成贵；

【机构】 中国农业大学作物有害生物监测与绿色防控农业部重点实验室；

【摘要】 芸薹黄化病毒（Brassica yellows virus,BrYV）是本实验室发现的一种新的马铃薯卷叶属病毒,与芜菁黄化病毒的亲缘关系较近。BrYV是一种正单链RNA病毒,在我国分布广泛,主要侵染十字花科植物,能够引起植株叶片黄化和卷曲的症状。BrYV基因组RNA含有7个ORFs,从5′端通过基因组翻译的ORFs依次产生P0、P1和P2,通过亚基因组策略翻译的ORFs依次产生P3、P3a、P4和P3^P5,根据BrYV基因组5′端的序列特点可分为A、B、C三种基因型。本研究在已经构建BrYV-A型侵染性cDNA克隆的基础上,通过利用同源重组的方法进一步进行带有标记基因的侵染性cDNA克隆的改造修饰。本研究成功构建了3种含有GFP标记基因的BrYV侵染性cDNA克隆。（1）在BrYV基因组的ORF2后插入2A-sGFP,该侵染性cDNA克隆简称为P2-2A-sGFP。（2）在BrYV基因组的ORF5后插入2A-sGFP,该侵染性cDNA克隆简称为P5-2A-sGFP。（3）将BrYV基因组的ORF5缺失,并在ORF3后插入2A-sGFP,该侵染性cDNA克隆简称为△P5-2A-sGFP。通过农杆菌浸润注射的方法将这3种载体浸润注射到本生烟叶片上,注射浓度OD₆₀₀=0.5,注射3 d后,运用Western blot方法分别检测病毒的外壳蛋白CP和GFP的表达量。结果表明:P2-2A-sGFP的CP表达量最少,GFP的表达量最多;P5-2A-sGFP与△P5-2A-sGFP的CP表达量正常,但前者GFP的表达量要多于后者。对于上述3种侵染性cDNA克隆是否能够系统侵染本生烟并表达GFP,尚需进一步对系统叶进行检测研究。本研究为深入研究BrYV的基因功能提供了有效GFP标记的病毒载体工具。更多还原