一种同步检测3种菠萝病毒的多重实时荧光定量RT-PCR方法

【作者】 罗志文； 胡加谊； 范鸿雁； 李向宏； 陈业光； 余乃通； 郭利军； 胡福初； 何凡； 刘志昕； 张治礼；

【机构】 海南省农业科学院热带果树研究所/农业部海口热带果树科学观测实验站/海南省热带果树生物学重点实验室/海南省热带果树育种工程技术研究中心； 黄埔出入境检验检疫局； 中国热带农业科学院热带生物技术研究所/农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室；

【摘要】 菠萝凋萎病是菠萝生产中的一种重要病害,目前尚难防控。为实现菠萝植株病毒快速定量检测和实时监测,笔者根据NCBI报道的3种菠萝凋萎相关病毒(PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3,PMWaV-1、-2、-3)的外壳蛋白基因(Coat Protein gene,CP gene)保守序列,分别设计合成3种病毒的特异性引物和TaqMan探针,通过多重RT-qPCR反应体系优化,进而以3种病毒CP基因目的片段的重组质粒为标准品绘制标准曲线,初步建立了针对3种目标病毒的三重RT-qPCR检测体系。试验结果表明:该体系对PMWaV-1、-2、-3的扩增效率分别为101.7%、97.1%和106.7%,线性相关系数R~2为0.996~0.999,可信度高;对PMWaV-1、-2、-3的最低检测线分别为99拷贝、98拷贝和868拷贝;重复性实验结果显示,该体系下PMWaV-1、-2、-3三重RT-qPCR扩增曲线的标准差均不超过0.26,变异系数均不超过1.44%。这表明本研究针对PMWaV-1、-2、-3初步建立多重RT-qPCR检测体系是一种能够快速、灵敏、稳定地同步定量检测目标病毒的方法,这为菠萝凋萎相关病毒(Pineapple Mealybug Wilt-associated Viruses,PMWaVs)的定性定量研究和未来开展复合侵染机制研究提供了技术支撑。更多还原