苹果褪绿叶斑病毒互作寄主因子的鉴定

【作者】 王亚迪； 李楠； 吕运霞； 王树桐； 胡同乐； 王亚南； 曹克强；

【机构】 河北农业大学植物保护学院；

【摘要】 苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leafspot virus,ACLSV)是苹果上危害最大的一类潜隐性病毒,广泛分布于世界各地。该病毒单独侵染或与其他病毒混合侵染严重影响果树产量及果实品质,造成严重的经济损失。本研究在利用酵母双杂交技术筛选能与ACLSV CP、MP互作的苏俄苹果寄主因子的基础上,通过生物信息学分析,从中选取可能具有重要功能的寄主因子,利用酵母双杂交、Pull-down技术进行进一步互作验证。主要研究结果如下:(1)构建带有完整寄主基因Malus4-1、Malus15-1、Malus40-5、Malus72-3、Malus85-1、Malus86-1的酵母双杂交表达载体。利用共转化法将诱饵载体pGBKT7-CP、pGBKT7-MP与带有上述6种寄主基因的酵母表达载体转化至酵母菌株Y2H gold中,将共转化产物涂布于四缺(SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal)培养基上,观察酵母的生长及显色情况,验证寄主功能基因与寄主基因之间的互作。结果表明,寄主因子Malus15-1、Malus40-5在四缺平板上菌落呈明显蓝色,证明CP、MP与寄主因子Malus15-1、Malus40-5互作。(2)构建原核表达载体pET28a-CP、pET28a-MP、pET28a-15-1和pET28a-40-5,然后将重组载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,并诱导表达目的蛋白。采用Pull-down方法,将洗脱产物经SDS-PAGE、Western blot检测蛋白间的互作。结果表明,以CP为诱饵捕获Malus15-1蛋白,洗脱产物中有21.5 kDa、16 kDa两条明显条带;以MP蛋白为诱饵捕获Malus15-1蛋白,洗脱产物中有50.8 kDa、16 kDa两条条带,证明CP、MP与Malus15-1之间存在直接相互作用。同样分别以CP、MP为诱饵捕获Malus40-5蛋白,洗脱产物中仅有一条条带,证明CP、MP与Malus40-5蛋白之间无相互作用。Malus15-1为苏俄苹果PR10基因。研究结果将为揭示寄主基因在ACLSV侵染过程中具有的生物学功能及两蛋白互作的意义奠定基础。更多还原