自噬相关基因Atg7敲除对三邻甲苯磷酸酯诱导的Neuro-2a细胞轴突损伤的影响

【作者】 陈易斯； 宋福永； 谢克勤；

【机构】 山东大学；

【摘要】 目的:三邻甲苯磷酸酯（Tri-ortho-cresyl phosphate,TOCP）在工业生产中广泛运用,可导致迟发性神经病的发生,但其确切机制尚不清楚。自噬是真核细胞中蛋白质降解的主要机制,对于细胞维持自身稳态具有重要作用。本课题通过研究自噬在TOCP诱导的Neuro-2a（N2a）轴突损伤中的作用,探索TOCP诱导迟发性神经病（organophosphate-induced delayed neuropathy,OPIDN）的发生机制。方法:1.利用CRISPR/Cas9技术,将靶向Atg7基因的Cas9和sgRNA修饰系统导入野生型N2a细胞中,经单细胞筛选、HMA试验和基因测序,制备自噬缺陷型N2a细胞。2.培养野生型和Atg7基因敲除的自噬缺陷型N2a细胞,当两种细胞分化48h后分别以0、5、10μM浓度的TOCP染毒,观察比较两种N2a细胞轴突变化情况。3.细胞免疫荧光法检测自噬的缺失对N2a细胞中轴突转运蛋白dynaction和自噬活性蛋白LC3B的水平影响。4.Western blotting检测Atg7以细胞和野生型细胞中LC3、p62、p-p62、beclin-1、k48-Ub、k63-Ub、kinesin以及dynactin等自噬相关蛋白以及促进轴突损伤相关蛋白SARM1、p38、p42、jnk的变化情况。结果:1.利用CRISPR/Cas9技术成功制备出Atg7^-/-N2a细胞,经EBSS饥饿诱导试验,鉴定为自噬缺陷型细胞。2.使用TOCP染毒后,两种细胞轴突长度明显缩短,且随着TOCP染毒剂量的增加,轴突损伤逐渐加重。同一剂量下,基因敲除的细胞轴突缩短程度相较于野生型的小。3.随着TOCP染毒剂量的增加,两种细胞中轴突微管马达蛋白Dynactin表达下降,自噬泡荧光亮点增多。4.野生型N2a细胞中beclin-1、LC3-Ⅰ含量减少,而LC3-Ⅱ含量明显增加。自噬缺陷细胞LC3-Ⅱ不表达,LC3-Ⅰ没有明显变化,而beclin-1同样呈现下降趋势。两种细胞中P62和p-p62水平上调,轴突运输马达蛋白dynatin和kinesin表达减少。而K48-位点泛素蛋白水平增加,K63-位点连接的泛素蛋白水平无明显变化。对轴突损伤具有促进性作用的激酶和蛋白p38、p42以及SARM1表达增加,jnk表达减少。结论:自噬基因Atg7敲除对三邻甲苯磷酸酯引起的Neuro-2a细胞轴突损伤具有保护性的作用,抑制自噬有可能成为OPIDN的干预措施。更多还原