针对鸭乙肝病毒C基因设计的Taqman实时荧光定量PCR方法

【作者】 王亚文； 惠凌云； 冯艾； 王威； 张琳； 马列婷； 王全颖； 杨广笑； 刘正稳；

【机构】 西安交通大学医学院第一附属医院检验科； 西安华广生物工程公司； 西安交通大学医学院第一附属医院感染科；

【摘要】 目的针对鸭乙肝病毒C基因保守区,建立检测DHBV-DNA的通用性Taqman实时荧光定量PCR方法。方法比较GenBank中所有国内、外报道的北京麻鸭DHBV Core区的核酸序列,采用DNASIS V2.5软件筛选出最大一致性的保守区核酸序列,以此为模板,设计、合成引物和Taqman荧光探针。构建pGEM-T/DHBV Core重组质粒,制备PCR标准品。通过优化反应体系和扩增条件,建立检测DHBV-DNA的Taqman实时荧光定量PCR方法,并进行方法学考察。结果 PCR扩增产物经测序,结果与GenBank M60677.1 DHBV complete genes完全相同。本文建立的方法标准曲线计算回归方程Y=-3.989X+49.086,r²=0.9993。方法的灵敏度为10³copies/ml,线性范围可达10³¹0¹⁰copies/ml。对自制质控品20次连续检测结果取常用对数平均值为5.81,SD为0.26,CV为4.47%。对1分份鸭外周血DHBV DNA连续5天进行检测,每天重复3次,其批内标准差为0.237,批间标准差0.064。同一反应体系和扩增条件下ABI7300荧光定量PCR仪和Bio-Rad IQ5荧光定量PCR仪的结果一致。两台仪器使用本方法均未检出DHV、HBV及E.coli DNA。结论本文在DHBV最稳定的Core区筛选出一致性最大的保守区设计PCR引物和探针,避免了DHBV S基因、P基因的变异及DHBV不同基因亚型之间的差异,建立通用型的荧光定量PCR方法,本方法灵敏度高、特异性强、重复性好,通用性强。更多还原