碱性果胶酶PEL168的分子改造和在生物煮练中的应用

【作者】 望潇文； 卢争辉； Jonathan Nimal Selvaraj； 蒋思婧； 易犁； 张桂敏；

【机构】 生物催化技术湖北省工程实验室湖北大学；

【摘要】 碱性果胶酶可用于苎麻脱胶和棉织物前处理的精练工艺,与传统的高温碱煮方法相比,具有保护纤维、降低能耗、水耗等优势。碱性果胶酶PEL168的比酶活为353 U/mg,在50℃时的半衰期为2 h,该蛋白的晶体结构已经被解析。本研究基于对PEL168的结构分析,分别从增加盐桥,增加二硫键、增加局部结构的柔韧性等方面进行理性设计提高PEL168的比酶活和稳定性,但是大部分设计都造成了酶活的降低或者完全失活,只得到了一个比酶活提高1.32倍,pH稳定性提高的突变体V132F。因此采用随机突变进行改造,利用error-prone P℃R建立突变体文库,通过果胶底物平板初筛和96孔板复筛得到一个比酶活提高1.81倍的突变体K47E(640U/mg),在50℃时的半衰期也延长至4.5h。鉴于有利突变的累积效应,将突变位点V132F和K47E进行组合,得到双突变体K47EN132F,其比酶活提高至873 U/mg。由于第47号位点的突变是随机得到的,暗示该位点对PEL168的比酶活有着重要的影响,随后以双突变体K47EN132F为模板对47号位点进行定点饱和突变,筛选到比酶活提高至1388 U/mg的突变体K47D/V132F。最后根据文献报道的嗜热果胶酶或者最适温度较高的碱性果胶酶与PEL168进行同源序列比对,在活性中心附近确定了突变位点R272W/Y,最后获得突变体K47D/V132F/R272W,相对于野生型,其比酶活提高了4.37倍(1544 U/mg),在50℃时的半衰期延长至5.6 h,动力学参数测定发现其催化效率也明显提高。结构分析发现K47D/V132F/R272W催化三联体的空间距离增加,使得底物更加容易与活性中心结合,且非共价键的增加使得催化三联体的结构也变得更加稳定,从而突变体的比酶活提高;47号位点氨基酸残基处的氢键增加,整个突变体的折叠自由能降低,使蛋白结构变得更加稳定可能是热稳定性增加的原因。为了测试该碱性果胶酶生物精练的效果,用胚布进行了酶法煮练的小试,发现用突变体酶K47D/V132F/R272W处理胚布后,胚布的润湿性明显增强,润湿圈面积为14.13 cm2,布料也变得更加柔软,而未经酶处理的布润湿性很差,润湿圈面积只有2.00 cm2。扫描电子显微镜(SEM)观察也发现经过酶处理后的纤维表面更加光滑。更多还原