荚膜甲基球菌异柠檬酸脱氢酶的酶学鉴定

【作者】 李山； 王鹏； 朱国萍；

【机构】 安徽师范大学分子生物学及生物技术研究所；

【摘要】 异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase,IDH）是三羧酸循环中的关键限速酶,以二价金属离子Mn²⁺或Mg²⁺为激活剂,催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸和CO₂,同时生成还原性NAD（P）H。酶学研究显示,来自荚膜甲基球菌（Methylococcus capsulatus）的IDH(IDH^Mc)属于NAD⁺依赖型IDH,Mn²⁺为最适金属离子,IDH^Mc对NAD⁺的催化效率是对NADP⁺的140倍(Mn²⁺)。SDS-PAGE显示分子量约为36 kDa,超速离心分析显示IDH^Mc为四聚体聚合形式。以Mn²⁺为激活剂时,IDH^Mc最适pH为7.5,最适温度为52℃左右,比极端嗜热菌海栖热孢菌（Thermotoga maritima）的NADP-IDH（90℃）的最适温度低,但与运动发酵单孢菌（Zymomonas mobilis）的NAD-IDH（55℃）的最适温度相近。此外,本研究构建了单点突变体酶和两点突变体酶。与野生型IDH^Mc相比,单点突变体酶D268K对NADP+的亲和力显著提升;两点突变体酶D268K/I269Y对NADP⁺的亲和力上升了13倍,催化效率提高了95倍。D268K/I269Y对NADP⁺的偏好性([K_cat/K_m]^NADP+/[K_cat/K_m]^NAD+)是其对NAD⁺偏好性的9.55倍,说明这两个位点的改造,已经实现了IDH^Mc从NAD⁺-依赖型向NADP⁺-依赖型的转变。IDH^Mc为目前唯一报道的NAD⁺依赖的同源四聚体IDH,对其功能的鉴定将会为IDH^Mc的结构研究奠定基础。更多还原