诱导多能干细胞鉴定中启动子甲基化实验条件探索

【作者】 齐自娟； 崔亚洲； 时良； 栾静； 周小艳； 韩金祥；

【机构】 济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院； 山东省医药生物技术研究中心山东省医学科学院；

【摘要】 在通过电转获得了诱导多能干细胞之后,需要对诱导多能干细胞的多能性基因NANOG和OCT4进行启动子甲基化检测,以确定高表达的多能性基因已经去甲基化。采用重亚硫酸盐试剂盒处理来对细胞基因组进行甲基化,通过PCR方式获得所需甲基化目的片段,连接PMD-18T载体,转化大肠杆菌并扩增,最后测序获得目的序列,以判断多能性基因启动子去甲基化程度。在使用重亚硫酸盐试剂盒处理过程中,基因组碱基长度,碱基序列都发生剧烈变化,所以给后续PCR反应造成了较大困难。基因组中目的片段含量较少,所以采取了较为灵敏的巢式PCR方式来获取所需目的片段。巢式PCR反应条件是获得目的片段的重要关卡。因此进行了对照实验以确定最佳条件。实际操作中,同时使用具有高保真性KOD酶和具有热启动特性Taq酶,三次重复实验发现热启动特性Taq酶因其高灵敏性,在琼脂糖电泳中获得亮度较高目的条带,高保真KOD酶则基本没有目的条带。使用热启动特性Taq酶,在具体PCR反应中,退火温度与常规PCR反应没有区别。但延伸温度,三次重复实验后,68℃退火温度相较于72℃常规退火温度,经过琼脂糖凝胶电泳目的条带显示亮度更高且特应性更佳。因巢式PCR进行两轮PCR扩增,第一轮PCR产物需要作为第二轮PCR模板,在加入第一轮产物0.5/1/3u1三个梯度对照中,电泳显示1ul一轮产物对于第二轮最后结果条带特应性更好。更多还原