BCA介导的CAR-T对结直肠癌的杀伤作用

【作者】 曾思衡； 姚志坚； 袁洋洋； 郭睿； 解军； 傅松涛； 于保锋；

【机构】 山西医科大学生物化学与分子生物学教研室；

【摘要】 结直肠癌(包括结肠癌、直肠癌和肛门癌)是常见的消化道恶性肿瘤,占胃肠道肿瘤的第二位。好发部位为直肠及直肠与乙状结肠交界处,占60%。发病多在40岁以后,男女之比为2:1。在全球范围内为男性第3位、女性第2位高发性恶性肿瘤,每年新发约120万例,死亡约60万例。最常用的治疗以手术切除癌肿为首选,辅之以放射治疗、化疗药物治疗及中医药、免疫治疗,但晚期则以放疗、化疗、中药、免疫治疗为主,手术仅为姑息切除或对症处理。免疫治疗作为一个新兴而且高效的治疗方法受到广泛关注。正常人体内每天可能有10~7到10~8细胞突变。机体免疫系统能够识别这些突变细胞为异己,并通过免疫机制在其尚未形成肿瘤前从体内消除。肿瘤免疫逃逸(Tumor escape)是指肿瘤细胞通过多种机制逃避机体免疫系统识别和攻击,从而得以在体内生存和增殖的现象。肿瘤免疫逃逸的机制有抗原提呈细胞的抗原识别加工提呈障碍、肿瘤细胞MHC异常所致的免疫识别障碍、T细胞应答能力下降或缺失、肿瘤抗原表达减少、Fas/Fas L诱导免疫逃逸等。针对肿瘤细胞的免疫识别障碍、T细胞应答能力下降或缺失、肿瘤抗原表达减少等免疫逃逸机制,科学家们研制出了免疫细胞疗法,是指把肿瘤的特征"告诉"免疫细胞。即通过基因改造的方法,让T细胞表面表达能识别肿瘤特异抗原的受体,让它们去定位肿瘤细胞,并激活T细胞强大的杀伤作用来杀伤肿瘤细胞。目前最成熟的是CAR-T,TCR-T。嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T-cell,CAR-T),第一代CAR由识别肿瘤表面抗原的单链抗体(scFv)和免疫受体酪氦酸活化基序(CDξ)组成,第二和第三代CAR中引入了共刺激分子信号,如CD28、CD134等,显著提高了T细胞对靶细胞的杀伤能力、增值能力、体内维持时间、细胞因子释放。我们选择的靶点为肿瘤表面特异抗原BCA,原因是抗原BCA在正常细胞、异型增生上皮及肿瘤组织的表达表现出明显的上升梯度。在正常细胞也有表达,但在重要器官上都没有表达或者表达率极低。常见肿瘤中BCA的表达情况:食管癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌均达到或接近100%。抗原BCA在胃肠道肿瘤细胞>95%,与肿瘤细胞的增殖及肿瘤预后有密切关系。抗原BCA的表达与肿瘤的预后相关,近年来,BCA已经成为肿瘤免疫治疗的一个新靶点。而且抗BCA的单抗卡妥索单抗已在欧洲获准用于治疗BCA表达阳性的肿瘤患者的恶性腹水。本课题选择第三代的CAR-T进行研究,以BCA为靶点,制备一种抗BCA-CAR-T细胞并检测其在体外对结直肠癌细胞的杀伤效率。实验步骤包括质粒载体的构建、慢病毒的包装,转染T细胞、表达验证及杀伤实验。首先查找抗BCA抗体的序列,并获得抗BCA抗体的scFv区。然后再查找CD毛信号区、CD28信号区、CD137信号区、CD8TM、CD8铰链区的序列。将其交给公司按第三代CAR的顺序合成,并构建含有目的基因的质粒及包装慢病毒。将包装好的慢病毒转染T细胞,流式检测CAR在膜上的表达情况,如果表达可以的话将进行下一步的肿瘤细胞杀伤实验,实验设立5组,分为实验组:BCA/CAR-T细胞与BCA+肿瘤细胞、阴性对照:BCA/CAR-T细胞与BCA阴性细胞、空白对照组:未感染慢病毒的T细胞与BCA阴性肿瘤细胞、空白对照组:未感染慢病毒的T细胞与BCA+性肿瘤细胞、空白对照组:感染空载体慢病毒T细胞与BCA+肿瘤细胞进行实验,共培养两天后用CCK-8法和/或流式细胞仪检测BCA/CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。更多还原