miR-375过表达对P19细胞增殖、凋亡及对斑马鱼胚胎心脏发育的影响

【作者】 王丽华； 宋桂仙； 郭锡熔； 周晓玉；

【机构】 南京医科大学附属南京儿童医院； 南京医科大学附属南京市妇幼保健院；

【摘要】 目的:构建miR-375过表达质粒,筛选出稳定过表达miR-375的P19细胞株,研究miR-375过表达对P19细胞增殖、凋亡的影响;获得miR-375过表达影响斑马鱼胚胎心脏发育的表型。方法:构建miR-375过表达质粒,与GFP(green fluorescent protein,绿色荧光蛋白)对照载体分别转染P19细胞,嘌呤霉素筛选两周,荧光观察和qRT-PCR验证筛选出稳定过表达miR-375的细胞株。CCK-8法检测两组细胞增殖情况,流式细胞仪术检测细胞周期情况;在细胞凋亡方面首先采用Hoechst染色的方法获得细胞凋亡的形态学证据,随后使用流式细胞术统计出两组细胞的细胞凋亡率,最后从凋亡相关基因入手,分别采用实时荧光定量PCR和Westem blot技术,检测凋亡相关基因Bax,Bcl-2两者的mRNA比值及蛋白表达水平,以评价miR-375过表达对P19细胞凋亡的影响;饲养斑马鱼,采用显微注射技术观察miR-375过表达对斑马鱼胚胎心脏形态学的影响。结果:miR-375过表达明显抑制了P19细胞的增殖;miR-375过表达通过抑制P19细胞进入S期进而影响了细胞周期。Hoechst染色及流式细胞术结果均提示miR-375过表达致P19细胞凋亡率增加;而凋亡相关基因Bax/Bcl-2比值增高;在动物实验方面证实miR-375过表达可致斑马鱼胚胎发育出现心包水肿等心脏畸形表型。结论:miR-375过表达能够影响P19细胞的增殖与凋亡功能,并致斑马鱼胚胎发育出现心包水肿等心脏畸形表型。更多还原