伏立诺他对惊厥后大鼠海马小胶质细胞TLR4/MYD88信号通路的影响及TLR4基因的表达调控

【作者】 胡擎鹏； 贺琳； 刘利群； 刘玲娟； 毛定安；

【机构】 中南大学湘雅二医院儿童医学中心；

【摘要】 研究背景惊厥频繁发作可导致不可逆的脑损伤。TLR4可介导小胶质细胞的活化、炎性细胞因子的表达及海马神经元细胞的凋亡,参与了惊厥性脑损伤的发生。组蛋白去乙酰化酶抑制剂伏立诺他(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)可通过提高染色质特定区域组蛋白乙酰化,从而调控基因表达,诱导细胞凋亡及分化。但SAHA对发育期惊厥后小胶质细胞炎症信号的影响及表观遗传学调控目前尚未涉足。本研究拟探讨SAHA对发育期惊厥后小胶质细胞TLR4/MYD88炎症信号的调节作用及对TLR4转录水平组蛋白乙酰化调控影响。研究方法海人酸(kanic acid,KA)腹腔注射制作发育期大鼠惊厥动物模型、原代分离培养海马小胶质细胞并以海人酸及组蛋白去乙酰化抑制剂SAHA进行干预,Western Blot检测惊厥后2h、6h、1d、3d和7d各时间点海马组织和小胶质细胞中TLR4、MYD88、NF-kB和IL-1β蛋白表达;qRT-PCR方法检测TLR4、MYD88、NF-kB和IL-1βmRNA的表达;CD68免疫组化染色观察并计数活化的小胶质细胞;TUNEL染色检测大鼠海马神经元细胞凋亡;染色质免疫沉淀技术检测TLR4组蛋白调控位点H3及H3K9的乙酰化水平。结果Western Blot和qRT-PCR检测海马组织及小胶质细胞中TLR4、MYD88、NF-kB和IL-1β蛋白和mRNA的表达,发现在KA惊厥组、KA+SAHA治疗组、SAHA对照组和NS对照组有显著差异,其中以KA组蛋白和mRNA表达最高,KA+SAHA治疗组次之,SAHA对照组和NS对照组最低。CD68免疫组化染色和TUNEL染色检测海马组织发现,惊厥后小胶质细胞的活化和神经元的凋亡显著增加,而SAHA治疗后能明显的抑制该病理过程。CHIP检测发现,TLR4转录过程中H3乙酰化水平KA+SAHA治疗组明显高于KA惊厥组及对照组,而H3K9的乙酰化水平KA惊厥组高于KA+SAHA治疗组及对照组;KA可使TLR4转录过程中H3乙酰化水平显著降低,SAHA可改善KA致惊厥后H3乙酰化水平,而H3K9的乙酰化水平与H3乙酰化水平呈相反趋势;且TLR4的表达量与H3K9的乙酰化水平呈正相关。结论组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA能抑制惊厥后TLR4/MYD88信号通路,减少炎症反应及脑损伤;并能在转录过程通过表观遗传机制调控TLR4基因的组蛋白乙酰化水平,从而减少TLR4的合成。更多还原