兔出血症病毒基因组克隆与病毒抗原性相关遗传变异分析

【作者】 肖跃强； 刘吉山； 魏凤； 杨慧； 沈志强；

【机构】 山东省滨州畜牧兽医研究院； 山东绿都生物科技有限公司；

【摘要】 引言兔病毒性出血症病毒(RHDV)基因组ORF1、ORF2分别编码257kD多聚蛋白、次要结构蛋白VP10,多聚蛋白裂解为p16、p23/p26、p37、p29、p13/p14、p15与p58等非结构蛋白与病毒主要结构蛋白-VP60。VP60变异性是病毒基因型分类的依据。目前该病毒被分为"原始"毒株与变异毒株。国外学者等认为变异株构成一种新亚型PHDVa,1985年在我国流行毒株NJ株就属于RHDVa亚型。本研究对先前分离的SQ-1变异群毒株进行了时空遗传演变分析。材料与方法根据已发表序列设计引物并克隆RHDV SQ-1株病毒基因组序列,测序后应用DNAstar软件对所测得序列与GenBank已发表29株病毒株基因组非结构与结构蛋白序列进行比较,分析其遗传变异特性。结果与讨论(1)非结构蛋白分析:非结构蛋白p16、p23/p26、p37、p29、p13/p14、p15与p58与其它株病毒核苷酸序列同源性分别在85.5%-96.5%、86.9%-96.6%、86.3%-96.0%、86.1%-95.8%、85.4%-94.4%、86.7%-97.4%与85.7%-96.6%之间,除p13/p14(VPg)外,其余蛋白均与NJ2009株同源性最高,与CB194-Pt同源性最低。p13/p14与NJ2009株、Triptis、WHNRN毒株的同源性最高,与Bahrain同源性最低。(2)结构蛋白序列分析:VP60蛋白测序结果表明,SQ-1与国内流行毒株核苷酸序列同源性最高为97.4%(NJ/China/1985),氨基酸序列最高99.5%(YL/2006株、whn-03株);与国外俄罗斯Manihino-09核苷酸序列同源性最高,为98.0%,高于我国已经公布所有毒株,与95-05、Erfurt、Iowa2000氨基酸序列同源性最高,均为99.3%。而且分离时间差异较大,Manihino-09系2009年报道,whn-03与YL/2006分是2005年、2006年国内流行毒株,而SQ-1株系2011年分离。表明,SQ-1进化来源可能相对复杂,与地域分布、流行时间没有明显的相关性。根据分离时间排列比较,对国内外41株RHDVa群病毒进行了遗传变异趋势分析,发现随着时间推移,出现了304、305、414、425与432氨基酸位点逐渐演变,而且变异的频次越来越高,同时,也出现13、237、299、309、324、346、348与351等7个氨基酸位点仅在近期流行毒株开始出现变异,预示着RHDVa病毒未来可能发生的遗传进化趋势。将RHDVa病毒株与原始群19株病毒VP60蛋白氨基酸位点遗传演变进行了分析,两个群体存存在12个氨基酸位点的完全变异;原始群病毒在RHDVa毒株存在7、207、219、365与480氨基酸残基交互变异位点,可见这些位点一直是两群体毒株不断发生进化与回复变异。讨论本研究克隆了病毒株SQ-1基因组,将非结构蛋白、结构蛋白基因与已公布毒株基因组序列进行了序列比对分析,发现基于非结构蛋白基因的基因型分类高度一致.而且与VP60蛋白序列基因型分类的结果相似,进而说明毒株序列在遗传进化过程中突变具有方向一致性,因此,笔者认为以非结构蛋白为目的基因,也可作为判定毒株分类的一个重要依据。更多还原