猪致病性大肠杆菌O9菌蜕的制备及免疫保护力

【作者】 李书光； 胡琳琳； 王金良； 肖跃强； 沈志强；

【机构】 山东省滨州畜牧兽医研究院； 山东绿都生物科技有限公司；

【摘要】 引言菌影是由裂解基因E调控表达而形成的一种多形态、无活力的、具有一定抗原承载能力的、靶向全身和黏膜免疫系统的细菌菌体。基本上不含有基因组,但是有与原始菌体同样功能的抗原决定簇,能够激发细胞免疫和体液免疫系统。同时菌影含有脂多糖类、类脂A肽聚糖等免疫刺激复合物,具有一定的内在佐剂效应。目的:本试验以猪致病性大肠杆菌O9为对象,构建了大肠杆菌快速非质粒依赖型菌蜕菌株筛选平台,探索其融菌效率和免疫保护力,为猪大肠杆菌病的预防治疗和新型疫苗的研究提供理论依据。材料与方法(1)载体、菌株及相关试剂:猪致病性大肠杆菌O9为山东滨州畜牧兽医研究院重点实验室分离鉴定保存。(2)温控表达盒的构建:扩增的目的产物连接pMD-18T载体构建pMD-18T-E,酶切、PCR鉴定。双酶切pBV220和pMD-18T-E,使用T4 DNA连接酶连接。(3)受体菌感受态细胞的制备:-70℃保存。(4)同源重组:电压:1.8 kV,脉冲25μF,电阻200Ω条件下进行电击、筛选。(5)菌蜕的制备:样品组在4 2℃培养。(6)菌蜕安全性试验及免疫保护试验:使用5周龄非免疫健康小鼠随机进行。结果成功构建温控融菌表达盒,并成功将融菌基因融入猪致病性大肠杆菌O9。30℃继续培养的产物D600值持续升高,出现明显的增菌现象,42℃诱导融菌蛋白的表达,30~60min开始融菌,融菌动力学曲线直观的表现出样品组和对照组D600菌蜕的安全性试验及免疫保护性试验证实菌蜕的安全性可靠。结果皮下免疫组攻毒保护率最高达到71.43%。讨论(1)Red重组系统的运用,避免了重组臂长片段的应用,缩短了重组周期,提高了重组效率。(2)猪致病性大肠杆菌O9的安全性及免疫保护效果本试验未使用本动物开展猪致病性大肠杆菌O9菌蜕的安全性试验和免疫保护性试验,使用了对大肠杆菌敏感的昆明系小鼠,不能够完全替代本动物的试验。更多还原