HBx激活调控LncRNA-HIAL参与肝细胞肝癌发病机制的研究

【作者】 胡娇娇； 宋伟； 仇雪梅； 乔凤昌； 公丕海； 陆森； 樊红；

【机构】 "发育与疾病相关基因"教育部重点实验室东南大学； 南京医科大学附属第一医院； 东南大学医学院；

【摘要】 目的本研究意在进一步探索原癌蛋白HBx在肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)发生中的分子机制,如何通过作用lncRNA参与这一过程。方法利用HBx稳转肝正常永生化细胞系L02,高通量lncRNA芯片分析获得受HBx影响的lncRNA分子。生物信息学分析构建了lncRNA与mRNA间的共表达关系网络,再结合qPCR复正,筛选出一个HBx显著上调的lncRNA分子lncRNA HIAL。进一步通过qPCR在临床肝癌组织中对其表达进行检测。通过CCK-8、平板克隆形成实验、流式细胞术检测lncRNA HIAL对细胞增殖、凋亡及周期的影响。通过western blot及qPCR检测1ncRNAHIAL对周期相关基因表达的影响。RIP实验验证lncRNA HIAL与EZH2是否有结合,进一步通过CHIP实验检测lncRNA HIAL对靶基因p27启动子区H3K27三甲基化程度的影响。HIAL是否参与炎症信号通路?NF-kB信号通路是一个在肝癌中研究非常广泛的炎症信号通路,HIAL的启动子预测到了NF-kB结合位点,NF-kB是否可以调节HIAL的转录?使用NF-kB抑制剂PDTC及激活剂LPS刺激后通过qPCR检测HIAL表达。细胞炎症因子介导了炎症的发生,刺激炎症信号通路或者趋化免疫细胞对癌细胞的杀伤。而HBx可以促进IL-6,IL-8,IL-1β的表达,那么HIAL能否调节它们的表达?干扰HIAL后,qPCR检测IL-6,IL-8,IL-1β表达。结果筛选出一个HBx显著上调的lncRNA分子,其在肝癌临床病例中存在特殊的表达谱提示它可能涉及到"炎-癌"转化过程,并且表达水平与HBx存在正相关关系,命名为HBV相关肝癌炎癌转化相关lncRNA HIAL(HBV inflammation associated lncRNA)。细胞模型的研究结果表明HIAL参与细胞增殖、凋亡及细胞周期进程。HIAL可以抑制周期相关抑癌基因p27表达而促进CDK2蛋白的表达。HIAL能够结合PRC2复合物的组分EZH2,p27的第一外显子处被EZH2结合,并且HIAL影响了此处H3K27三甲基化程度。HIAL至少部分可以通过招募EZH2到p27第一外显子处表遗传沉默其表达。使用NF-kB抑制剂PDTC及激活剂LPS刺激后,HIAL的表达未发生变化,NF-kB不能促进HIAL的转录。干扰HIAL后,IL-6,IL-8,IL-1βmRNA表达下调显著。结论 HBx上调lncRNAHIAL,HIAL促进细胞生长至少部分通过抑制p27表达。HIAL对p27表达的抑制至少部分通过招募PRC2复合物的组分EZH2到其第一外显子处表遗传沉默其表达。本研究结果将有助于更加全面的理解HBx在诱发肝细胞癌中的调控机制,对于HBV慢性感染导致的肝细胞癌预防和治疗将可能提出新思路和切入点。更多还原