镉对大鼠肝细胞GJIC的影响及硫辛酸的保护作用

【作者】 邹辉； 胡迪； 韩涛； 刘学忠； 袁燕； 顾建红； 卞建春； 刘宗平；

【机构】 扬州大学兽医学院江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心；

【摘要】 【目的】研究细胞缝隙连接通讯(gap junctional intercellular communication,GJIC)在重金属镉致大鼠肝损伤中的作用以及硫辛酸的保护机制。【材料和方法】体外培养大鼠肝细胞系BRL 3A细胞,待细胞90%融合,用2.5μmol/L醋酸镉(Cd)、50μmol/L硫辛酸(LA)、5μmol/L GJIC抑制剂18-β-甘草次酸进行处理(GA),单独或共处理12 h,用MTT法检测细胞活力,用染料划痕示踪法检测GJIC的功能,用Hoechst33258染色法观测细胞核变化,用细胞实时分析系统检测细胞指数(Cell index,CI)的变化,Western blotting检测链接蛋白43(Connexin43,Cx43表达变化情况,免疫荧光法观察Cx43蛋白在细胞膜上的定位变化;通过Transwell细胞共培养体系观察Cd损伤细胞对正常细胞的影响。【结果】2.5μmol/LCd可时间依赖地引起BRL3A细胞CI下降,50μmol/LLA以及5μmol/LGA单独处理组与对照组相比,CI变化不明显,联合添加LA,CI下降速度降低,联合添加GA,CI下降速度加快;2.5μmol/LCd处理细胞12 h可导致细胞活力显著下降(p<0.01),细胞皱缩变圆,与邻近细胞分离,GA与Cd共培养,加剧了细胞形态学的变化,出现了更多的折光性强的坏死细胞,LA与Cd共培养则缓解了镉对BRL 3A细胞形态学上的损伤作用;对照组与50μmol/LLA单独处理组罗氏黄(Lucifer yellow,LY)向划痕两侧扩散的距离最大,2.5μmol/LCd组LY扩散距离显著小于对照组(p<0.01);与LA联合处理组LY扩散距离显著小于对照组,但显著大于2.5μmol/LCd处理组(p<0.05);对照组与LA处理组Cx43分布在细胞膜上,细胞间彼此相连,Cx43相应分布连接呈网状,2.5μmol/LCd组绿色荧光减少,细胞膜上几乎不见Cx43分布,Cx43进入细胞内,向细胞核靠近。与LA联合处理组的情况稍好,处于Cd处理组和对照组之间;在Transwell细胞共培养体系中,Cd损伤细胞能引起正常细胞变圆,细胞核皱缩、碎裂、染色质浓染等典型的凋亡形态学变化,在体系中添加LA或GA可明显抑制Cd损伤细胞对正常细胞的影响。【结论】Cd对大鼠肝细胞有毒性作用,并抑制GJIC,同时下调Cx43的表达并影响其分布。GJIC的抑制具有双重作用:(1)导致受损细胞孤立进而加剧了Cd的毒性损伤作用,(2)减少镉损伤细胞对正常细胞的影响,对正常细胞起到保护作用。LA可作为Cd损伤的保护剂,能部分恢复由镉抑制的GJIC,这可能是由于硫辛酸能上调Cx43表达和恢复其定位而实现的。更多还原