毒理学研究中DNA甲基化检测技术概述

【作者】 靳溪； 刘进； 席超； 刘恺；

【机构】 北京师范大学生命科学学院实验技术中心；

【摘要】 DNA甲基化是一种重要的表观遗传机制,可参与调控基因表达,是毒理基因组学和表观遗传毒理学研究的热点。已有研究表明多种外源化学物质可诱导机体DNA甲基化模式发生改变,这种变化可能具有短效或长效的毒理作用。了解化学物质对DNA甲基化状态的潜在作用有助于阐明化学物质的毒理作用机制,揭示个体对药物和毒素应答差异的本质,为药物安全性评价提供重要依据。早期的DNA甲基化分析关注单一或几个基因启动子区CpG序列的改变,随着检测技术的发展,近些年的研究更多集中在全基因组甲基化水平分析。目前,毒理学研究中应用的DNA甲基化检测分析技术主要包括以下几种。一、亚硫酸氢盐转化。亚硫酸氢盐处理基因组DNA后,胞嘧啶可转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶(5-甲基胞嘧啶)基本不发生改变,因此,亚硫酸氢盐处理后的检测样品中胞嘧啶来源于5-甲基胞嘧啶,通过这种方法可有效保留DNA的甲基化信息。目前,亚硫酸氢盐转化是多种甲基化检测技术的基础。亚硫酸氢盐转化与色谱技术结合形成变性高效液相层析技术;与PCR.技术结合形成甲基化特异性PCR(MS-PCR)、甲基化荧光检测法、甲基化敏感性高分辨率溶解曲线法(MS-HRM)以及亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)。亚硫酸氢盐转化与二代测序技术结合的Bs-Seq可检测全基因组甲基化水平,与焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)结合可对甲基化位点进行定性及定量检测。二、限制性内切酶。应用对甲基化敏感程度不同的限制性内切核酸酶可富集甲基化的DNA,是有效分析DNA甲基化的工具之一。常用的甲基化敏感性限制性内切酶有HpaII-MspI和SmaI-Xaml等。应用限制性内切酶检测DNA甲基化是一种简便的低成本方法。对限制性内切酶消化后的。DNA片段进行Southern杂交或者PCR扩增,可检测某个位点的甲基化状态。限制性内切酶与亚硫酸氢盐转化结合分析(COBRA)可准确定量样本的甲基化比例。限制性内切酶也应用于高通量甲基化芯片分析技术等。三、免疫沉淀。应用5-甲基胞嘧啶特异性抗体或含有甲基结合结构域蛋白的特异性抗体,通过免疫沉淀作用可富集基因组中的DNA甲基化片段。富集的基因组中DNA甲基化片段可应用杂交、芯片、大规模平行测序或荧光定量PCR等方法进一步分析。随着检测技术的持续发展和日臻完善,DNA甲基化检测新方法和新策略会不断出现,为科学研究提供有益的技术支撑和保障。更多还原