荧光定量实时PCR方法分析柞蚕核型多角体病毒对不同昆虫细胞的感染性

【作者】 赵振军； 王林美； 岳冬梅； 叶博； 张波； 范琦；

【机构】 辽宁省农业科学院大连生物技术研究所；

【摘要】 柞蚕核型多角体病毒(ApMNPV)通常只感染柞蚕、樗蚕等少数昆虫及所属细胞,具有较高的宿主专一性。我们曾发现ApNPVΔph/egfp~+在感染不同昆虫细胞后,绿色荧光蛋白有不同程度表达。为进一步了解ApNPVΔph/egfp~+在不同昆虫细胞中感染增殖情况,我们采用荧光定量实时PCR(Quantitative real-time Polymerase chain reaction,qRT-PCR)方法对Ap NPVΔph/egfp~+在昆虫细胞BmN、Tn-Hi5及Sf21中的增殖进行了分析。方法:(1)以PMD18-T/egfp质粒DNA为模板进行qRT-PCR检测,以CT值为纵坐标,拷贝数为横坐标建立标准曲线,以此为标准定量分析感染细胞中病毒拷贝数。(2)Ap NPVΔph/egfp+(MOI 5)分别感染Bm N、Tn-Hi5和Sf21昆虫细胞,在病毒感染后的第8、16、24、48、72、96和120小时分别收集细胞,提取基因组DNA,进行qRT-PCR。(3)为分析病毒感染细胞产生子代病毒对细胞的持续感染能力,分别收集上一代感染病毒120h的细胞培养液直接用于下一代感染相应的昆虫细胞,收集不同感染代数的昆虫细胞,提取细胞基因组DNA用于qRT-PCR。PCR结果参照标准曲线定量并绘制病毒增殖曲线。结果:ApNPV-Δph/egfp+在感染Tn-Hi5细胞24小时后,病毒增殖较快,感染72小时后,病毒增殖进入平稳期,病毒增殖速率降低,感染120h后细胞中病毒的拷贝数是感染8小时病毒拷贝数的100倍。而ApNPVΔph/egfp+在BmN和Sf21细胞中增殖缓慢。虽然ApNPV-Δph/egfp+可感染Tn-Hi5细胞,但随病毒感染代数增加,细胞中病毒的拷贝数呈下降趋势,与第1代感染的细胞中的病毒拷贝数相比,第5代感染细胞中的病毒拷贝数下降了约50%。而分别感染Ap NPVΔph/egfp+的Bm N和Sf21细胞的培养液几乎不能再次感染相应的细胞。qRT-PCR分析结果表明ApMNPV能够感染Tn-Hi5细胞,但在Tn-Hi5细胞中产生子代病毒的能力受到限制;而在BmN和Sf21细胞中复制增殖明显受到抑制,不能产生子代病毒对细胞产生继代感染。更多还原