核酸恒温扩增技术检测结核分枝杆菌的比较研究

【作者】 王慧党； 杨敏； 曹旭东； 陈创夫；

【机构】 石河子大学；

【摘要】 结核病是由结核杆菌引起的一种人畜共患传染病,结核杆菌是人和动物结核病的主要病原。人类的结核病可以通过呼吸或飞沫传给人或其他动物,动物结核病除了通过呼吸或飞沫外,还可以通过一些动物产品如肉、奶、蛋等畜产品进行传播。目前,最为常见的动物结核就是牛结核病,它不仅给畜牧业带来严重的影响,并且给人类的健康安全也造成了很大的威胁。近年来,人结核病的发病率明显上升,特别是儿童肠结核的发病率明显增加。因此,建立快速、准确、灵敏、价格低廉的结核病实验室诊断方法对结核病控制有着极为重要的意义。目的:建立一种快速、准确、价格低廉易于临床推广的,并可以运用于畜产品中结核杆菌检测的方法。方法:通过优化环介导恒温扩增检测技术与RNA恒温扩增技术的反应条件与体系,建立起两种可以用于牛乳中结核分枝杆菌检测的核酸扩增方法。本实验通过对牛奶中结核杆菌的DNA和RNA的提取方法以及对每种方法的反应体系、反应温度、反应时间进行优化,并对牛乳中结核杆菌检测的灵敏度、特异性、重复性进行检测,确定这两种方法对牛乳中结核杆菌的最低检测浓度(灵敏度)。同时还将环介导扩增技术与RNA恒温扩增技术同结核罗氏培养技术、抗酸染色镜检、PCR技术进行比较,评价与分析各种检测方法对牛乳中结核杆菌的检测结果,以确定最佳检测方法,为临床应用提供参考依据。结果:环介导恒温扩增技术和RNA恒温扩增技术的灵敏度、特异性、重复性都比较高,对牛乳中结核杆菌的最低检测浓度分别为3×101 CFU/m L和3×100 CFU/m L。RNA恒温扩增实时检测技术的灵敏度要明显高于环介导恒温扩增技术,并且是它的10倍。牛乳中结核杆菌的DNA与RNA的提取方法分别为改良后的CTAB/NACL法与改良后的手工提取RNA法。结核培养技术、抗酸镜检、PCR技术对牛乳中结核杆菌的检测的最低浓度分别为3×105 CFU/m L、3×108 CFU/m L、3×104 CFU/m L。结论:建立的环介导恒温检测技术与RNA恒温扩增技术可用于牛乳中结核杆菌的检测,这两种方法操作简单,对实验仪器要求不高,易于在产品检验与检疫中应用。与结核培养技术、抗酸镜检、PCR技术相比,对牛乳中的结核杆菌的检测浓度更低,灵敏度更高,RNA恒温扩增技术的灵敏度要比环介导恒温检测技术高10倍。更多还原