造血干细胞和单核细胞来源的树突状细胞在形态、表型及功能的对照实验研究

【作者】 董建涛； 刘刚； 蔡建辉；

【机构】 河北省人民医院；

【摘要】 背景:来自外周血单核细胞的自体DC疫苗作为一种很有前途的抗肿瘤免疫疗法,其面临的局限性包括细胞数量不足和功能缺陷。CD34+造血干细胞则是另一个理想的DC来源,已经有多种扩增CD34-DC的方法报道,都可以得到大量的细胞数和各种功能不同的DC。目的:本实验旨在探讨脐带血CD34+造血干细胞来源的树突状细胞(CD34-DC)与外周血单核细胞来源的树突状细胞(Mo-DC)在细胞形态、细胞表型、诱导生成的CTL细胞毒性方面的差异,并探讨不同来源的DC超微结构的变化与其抗原处理与抗原提呈功能之间的相关性,以期制备功能更加强大的DC疫苗。方法:取健康成人外周血,采用密度梯度离心法获取单核细胞后诱导生成DC(Mo-DC);取健康足月产孕妇脐带血,采用磁珠分选法分离纯化CD34+造血干细胞,并培养于含粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)/干细胞因子(SCF)的培养基诱导CD34+造血干细胞扩增及DC前体细胞的生成,GM-CSF/白细胞介素-4(IL-4)培养基进一步诱导前体细胞向DC细胞的分化(CD34-DC)。电镜下观察CD34-DC及Mo-DC的形态,比较其细胞突起数量、细胞核大小及内体小泡数量;流式细胞术检测不同培养时间(d1,d3,d5,d7)的CD34-DC及Mo-DC表面分子表达,并给予FITC-OVA257–264冲击,培养24 h后检测其抗原提呈能力;取培养至d 5的CD34-DC及Mo-DC均负载CEA蛋白并加入肿瘤坏死因子(TNF-α)制备成CEA特异性的CD34-mD C、Mo-mD C(即DC疫苗),分别体外诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)生成,并利用MTS法检测其各自对CEA高表达的肿瘤细胞系Ls174-T的细胞毒性,以检测其激活T细胞的功能。结果:(1)经过细胞因子和肿瘤抗原刺激之后的DC,悬浮生长而失去树突状外观,表现为类圆形,细胞膜清晰且光滑。(2)与抗原提呈能力密切相关的内体小泡数量在CD34-DC中多于Mo-DC(P<0.05)。(3)Mo-DC与CD34-DC经抗原及细胞因子刺激生成的Mo-mD C与CD34-mD C均可成熟(P>0.05)。(4)CD34-DC比Mo-DC具有更强的抗原提呈能力(P<0.05)。(5)CD34-DC与Mo-DC在刺激同种异体T淋巴细胞的增殖能力方面无差异(P>0.05)。6 CC-CTLs及CM-CTLs都可以杀伤CEA高表达的肿瘤细胞Ls174-T,但CC-CTLs比CM-CTLs有更高的杀伤率(P<0.05)。结论:(1)经GM-CSF/SCF培养基可诱导脐带血CD34+造血干细胞扩增及生成DC前体细胞,并在培养d8开始贴壁生长,每3天可收获一批DC前体细胞,用GM-CSF/IL-4培养基可进一步诱导生成CD34-DC,其表型与Mo-DC无差异。(2)脐血造血干细胞来源的CD34-DC具有更强的抗原提呈、促淋巴细胞增殖及诱导激活CTL的能力。(3)电镜下树突状突起数量、细胞核大小及内体小泡数量的变化是评估DCs功能差异的微观机制。(4)脐带血来源的CD34-DC有望成为制备DC疫苗新的、理想的原料细胞。更多还原