中国小麦花叶病毒CP和CRP蛋白的原核表达、抗血清制备及RNA2侵染性克隆构建

【作者】 孔凡惠； 脱建波； 魏娇； 唐伟； 李向东； 迟胜起； 田延平； 于金凤；

【机构】 山东农业大学植物保护学院植物病理学系； 青岛农业大学农学与植保学院；

【摘要】 中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)引起的小麦土传花叶病在山东烟台、威海等地危害严重。本研究克隆了CWMV烟台分离物的外壳蛋白(Coat Protein,CP)及富含半胱氨酸蛋白(Cysteine-rich protein,CRP)基因,并将其连接到原核表达载体pEHISTEV,转化大肠杆菌Rosetta。经IPTG诱导,表达出分子量均为19kDa的CP和CRP。将二者从凝胶中切下,乳化后免疫新西兰大耳兔4次,获得了两种蛋白的多克隆抗体。ELISA检测表明,CWMV CP和CRP抗血清的效价分别为1:4 096和为1:2 048。Western blot分析证明该抗血清只与感染CWMV的小麦有特异性反应,而与健康小麦或感染小麦黄花叶病毒的小麦无反应。利用含T3启动子的引物通过RT-PCR扩增CWMV RNA2全长片段,经T/A克隆连接到pMD18-T,获得质粒pMD18-T-CWMV-RNA2。该质粒经Xba I线性化后,利用T3 RNA聚合酶进行体外转录,转录产物摩擦接种本氏烟,15℃培养3 d后,利用Western blot可从接种叶片中检测到瞬时表达的CWMV CP蛋白。更多还原