调控基因fliZ,gltB和serA对枯草芽孢杆菌Bs916定殖能力与防效的影响

【作者】 周华飞； 罗楚平； 方先文； 向亚萍； 王晓宇； 张荣胜； 陈志谊；

【机构】 江苏省农业科学院植物保护研究所；

【摘要】 枯草芽孢杆菌Bs916作为一株优秀的生防细菌,已经被成功用于防治水稻纹枯病、水稻稻瘟病及水稻稻曲病等水稻真菌性病害长达20多年。本文通过同源重组技术构建3个调控基因fliZ,gltB和serA单敲除突变株,研究了3个突变株及野生型菌株Bs916在接种水稻纹枯病菌的水稻茎秆上的定殖能力、对水稻纹枯病的防治效果、3种抑菌脂肽类抗生素bacillomycin L,surfactin和fengycin分泌含量的变化、对水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani的平板抑菌效果、生物膜形成能力及生物膜形成基本组分蛋白EPS和TasART-PCR转录分析、游动性和自身菌落形态的变化,综合评价3个调控基因对枯草芽孢杆菌Bs916定殖能力与防效的重要作用。试验结果表明:(1)分别敲除3个调控基因fliZ,gltB和serA均不同程度的影响了3种抑菌脂肽类抗生素bacillomycin L,surfactin和fengycin的分泌含量,相比于野生型菌株Bs916,敲除基因fliZ和serA均导致3种脂肽类抗生素的分泌含量的增加,而敲除基因gltB则丧失了脂肽类抗生素bacillomycin L的分泌,同时导致了脂肽类抗生素surfactin含量增加达到5倍之多,说明基因gltB对起到抑菌作用的脂肽类抗生素调控作用显著。(2)对于3个突变株及Bs916对水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani的抑菌效果分析发现,敲除基因fliZ和serA对于抑制水稻纹枯病菌无影响,但是,敲除基因gltB则完全丧失了对水稻纹枯病菌的抑制效果,本研究认为是由于丧失了bacillomycin L的合成导致对水稻纹枯病菌抑制效果的丧失,说明脂肽类抗生素bacillomycin L在对水稻纹枯病的抑菌试验中起到了主要的作用。(3)对于3个突变株及Bs916在接种水稻纹枯病菌的水稻茎秆上的定殖能力观察及防治效果的测定试验中发现,相对于野生型菌株Bs916,3个突变株均不能很好地定殖在水稻茎秆上且菌落不产生聚集效应,只是很分散的随机分布,菌体数量很少,而野生型菌株Bs916在病斑处可以产生明显的菌落聚集效应,菌落数量增加显著,在第十五天左右菌体数量基本消失。(4)对3个突变株的生物膜形成能力的观察表明,相比于野生型菌株Bs916,3个突变株的生物膜形成能力均丧失严重,且Bs916形成的生物膜具有明显的三维结构,而3个突变株形成的生物膜量少且仅有二维平面结构,对于生物膜形成必须组分蛋白EPS和TasA的半定量RT-PCR检测发现,3个突变株中均不能同时正常表达蛋白EPS和TasA,导致了其生物膜形成严重减弱。(5)对于3个突变株及Bs916游动性能力的检测发现,敲除基因gltB基本上丧失了游动性,敲除基因serA则增加了菌落游动性能力,表明基因serA对Bs916游动性能力有明显的调控作用。通过对3个突变株及Bs916在固体MSgg培养基上的菌落形态的观察发现,3个突变株均只能形成二维结构,而野生型菌株Bs916则可以形成明显的三维结构且边缘圆滑。敲除基因fliZ形成了明显的粗糙边缘,敲除基因gltB则形成明显的颗粒状的菌体结构,敲除基因serA则基本上形成菌落结构不完整且边缘不连续,因此,3个调控基因对于Bs916调控菌落结构及维持正常的菌体形态具有很大的影响。综上所述,3个调控基因fliZ,gltB和serA对于枯草芽孢杆菌Bs916在水稻茎秆上的定殖能力和对水稻纹枯病的防治效果均产生很大的影响,分别敲除3个调控基因均导致Bs916对水稻纹枯病防效的严重下降,同时3个调控基因对Bs916的生物膜形成有着显著的作用,因此,本研究认为由于分别敲除3个调控基因导致了Bs916在水稻茎秆上的定殖能力的严重下降最终导致了对水稻纹枯病的防效的显著严重降低,即枯草芽孢杆菌Bs916在水稻上的定殖能力起到了关键作用,其分泌产生的抑菌脂肽类物质起到了次要的作用。同时3个调控基因影响了菌落的游动性能力,使菌落不能快速扩张与繁殖,菌体数量达不到防治病原菌所需菌量,菌体形态出现异常,最终共同作用导致了对水稻纹枯病菌防治效果的严重丧失。更多还原