分枝杆菌蛋白质O-甘露糖基化的致病作用研究

【作者】 张飞； 杨淑凤； 沙珊珊； 辛毅； 马郁芳；

【机构】 大连医科大学生物化学教研室； 大连医科大学微生物学教研室； 大连医科大学生物技术系；

【摘要】 结核分枝杆菌蛋白质O-甘露糖基化与其在体外和体内的增殖及致病性有关。在分枝杆菌中,蛋白质O-甘露糖基化过程包括糖基化的起始和糖链的延长。起始过程是由聚戊烯醇-磷酸-甘露糖-蛋白质-甘露糖基转移酶（polyprenol-phosphate-mannose-protein mannosyl-transferase,PMT）将甘露糖基供体聚戊烯醇-磷酸-甘露糖（polyprenol-phosphate-mannose,PPM）的甘露糖基转移到蛋白质多肽链中Ser或Thr的羟基上。延长过程是由甘露糖基转移酶（mannosyltransferases）催化甘露糖基供体GDP-甘露糖（GDP-mannose）的甘露糖通过α（1,2）糖苷键连接到已有的甘露糖上。GDP-mannose的生物合成途径包括三步反应,磷酸甘露糖异构酶催化果糖-6-磷酸转变为甘露糖-6-磷酸,磷酸甘露糖变位酶催化甘露糖-6-磷酸转变为甘露糖-1-磷酸,GDP-甘露糖焦磷酸化酶催化GDP-mannose的生成。PPM合酶催化GDP-mannose和聚戊烯醇（polyprenol）形成PPM。结核分枝杆菌（M.tuberculosis）Rv1002c基因编码PMT,且为细菌生长必需基因。在模式菌耻垢分枝杆菌（M.smegmatis）中,MSMEG₅447为Rv1002c的同源基因。在本研究中,我们构建了MSMEG₅447基因敲除菌株（△M5447）,并确定MSMEG₅447为细菌生长的非必需基因。我们将结核分枝杆菌Rv1096基因转入△M5447菌株后,发现Rv1096蛋白不发生O-甘露糖基化。将分枝杆菌绿色荧光蛋白GFP表达载体pCG76-hsp60-gfp电转化到不同耻垢分枝杆菌菌株中,获得Msm/gfp、Msm/Rv1096/gfp、△M5447/gfp和△M5447/Rv1096/gfp菌株。用不同菌株分别感染小鼠巨噬细胞系RAW246.7,用Lyso-Tracker Red对溶酶体染色并用激光共聚焦显微镜进行观察,发现Msm/gfp及Msm/Rv1096/gfp组的菌体完整,菌体呈绿色杆状,而△M5447/gfp及△M5447/Rv1096/gfp组的菌体被消化,菌体呈绿色弥散状。结果表明O-甘露糖基化缺失菌株更容易被巨噬细胞溶酶体消化。我们将用不同菌株分别感染小鼠,进一步研究Rv1096蛋白的甘露糖链在致病中的作用。更多还原