近江牡蛎三个亲环蛋白家族成员的鉴定、表达及其功能研究

【作者】 许婷； 解家松； 杨受保； 叶仕根； 罗鸣； 吴信忠；

【机构】 浙江大学动物科学学院； 浙江省淡水水产研究所； 绍兴文理学院生命科学学院； 大连海洋大学水产与生命学院；

【摘要】 亲环蛋白(Cyclophilin,Cy P)最早于1984年在牛的胸腺细胞中克隆得到,因其能与免疫抑制剂环孢霉素A(Cyclosporin A,Cs A)特异性结合而得名,是Cs A的细胞内蛋白受体,能介导其免疫抑制功能。Cy Ps广泛分布于各种生物体内,到目前为止,已发现和克隆得到130余种Cy Ps异构体,构成Cy Ps蛋白家族。该家族蛋白具有典型的肽脯氨酰顺反异构酶(PPIase)活性,能够催化蛋白质折叠过程,具有分子伴侣作用。此外,Cs A还参与多项炎症反应,对单核细胞,中性粒细胞和嗜酸性细胞具有趋化作用,是一种重要的促炎因子和炎症介质。同时,Cy Ps具有诱导细胞凋亡的功能,且与多种疾病的发生发展密切相关。本研究首次克隆鉴定得到近江牡蛎三个亲环蛋白家族基因,Ca-Cy PA,Ca-Cy PB和Ca-PPIL3。在对其进行结构分析和同源性比较的基础上,完成了这三个基因的原核表达和抗体制备,并对其组织分布和在近江牡蛎抗类立克次体(RLO)感染中的作用进行分析和探讨。Ca-Cy PA编码165个氨基酸,Ca-Cy PB编码217个氨基酸,而Ca-PPIL3编码162个氨基酸。其预测氨基酸序列均包含典型的Cy P-PPIase结构域及其特征序列,而Ca-Cy PB还包含一个N端信号肽序列。同源性分析结果表明近江牡蛎三个亲环蛋白间的氨基酸序列相似度为35%-48%,而Ca-Cy PA与其他物种Cy PA氨基酸序列相似度为74-82%,Ca-Cy PB与其他物种Cy PB基因相似度为57%-70%,Ca-PPIL3与其他物种PPIL3基因相似度为71%-79%。通过表达载体构建,我们在大肠杆菌中成功诱导表达及纯化了Ca-Cy PA,Ca-Cy PB,Ca-PPIL3蛋白,并制备了多克隆抗体。此外,我们运用荧光定量PCR技术检测三个亲环蛋白家族组织表达及RLO刺激引起的近江牡蛎血淋巴细胞中的m RNA表达量变化。结果显示,Ca-Cy PA、Ca-Cy PB、Ca-PPIL3在近江牡蛎所有被检测的组织中均有表达,并且在血淋巴细胞中表达量最高。而在RLO刺激后,三个基因表达量均显著上调,预示着Ca-Cy PA、Ca-Cy PB、Ca-PPIL3可能参与了近江牡蛎抵抗RLO感染的免疫防御体系。更多还原