弱化NPT筛选标记建立高表达CHO细胞株筛选方法

【作者】 刘苏； 田浤； 王驰； 童玥； 高向东； 姚文兵；

【机构】 中国药科大学生命科学与技术学院；

【摘要】 近年来治疗性抗体药物飞速发展,作为表达外源基因的最佳真核宿主之一,高表达CHO工程细胞株的获得显得极为迫切。本研究目的在于优化CHO表达体系,建立高表达CHO细胞株筛选方法。将外源基因表达载体上抗性筛选基因表达的新霉素磷酸转移酶(neomycin-phosphotransferase,NPT)的261位氨基酸天冬氨酸突变成甘氨酸,突变型NPT酶活力仅为野生型的3%,只有外源基因整合在转录热点或(和)拷贝数高的少量细胞能够表达足够的NPT而在G418加压筛选过程中存活,大大增加获得高表达CHO细胞株的几率。同时将EGFP作为报告基因,与抗体IgG1的Fc结构域融合表达。在相同浓度G418加压筛选后NPT氨基酸的突变使外源蛋白表达量增加,从而筛选出高表达的CHO单克隆细胞株,并对该融合蛋白进行鉴定。结果表明转染含突变型NPT表达载体的细胞克隆率降低但是EGFP的表达量高于转染含野生型NPT表达载体的细胞,这表明其具有筛选出高表达单克隆细胞株的潜力。进一步对此多克隆细胞进行单克隆化筛选,获得的16株单克隆细胞中筛选得到1株EGFP表达量较高的细胞株。本研究证明了通过弱化NPT筛选标记获得高表达CHO细胞株的方法是提高真核药物蛋白表达量的一条有效途径,为建立高表达CHO细胞株提供了新的思路。更多还原