血管紧张素原基因pAGT-shRNA对大鼠EC细胞的影响

【作者】 杨国安； 和姬苓； 徐莹；

【机构】 包头医学院第一附属医院中心实验室；

【摘要】 目的:应用RNA干扰技术特异性抑制大鼠主动脉内皮细胞(EC)上表达丰富的血管紧张素原基因(AGT)的表达,为治疗缺血性脑血管疾病提供新的靶点。方法:构建携带AGT基因特异短发夹RNA(shRNA)编码序列的质粒载体,与脂质体转染剂以最佳配比复合,转染传代3-5代的大鼠主动脉细胞,转染后24h、48h、72h在倒置荧光显微镜下检测转染效率,通过RT-PCR法检测AGT mRNA的表达水平,Western blot法检测AGT的蛋白表达情况。结果:(1)当质粒与脂质体转染剂TMETAFECTENE EASY+以1:4的最佳配比复合时,转染48h时细胞转染效率最高为(67.25±2.49%)。(2)应用RT-PCR法检测转染后的大鼠主动脉内皮细胞AGT的mRNA含量,结果显示空白对照组、阴性对照组与干扰组的AGT mRNA相对表达量分别为100%,98.4%和24.3%,即干扰组与空白组以及阴性对照组相比mRNA的表达量明显下降(P<0.05)。(3)通过应用BCA蛋白定量试剂盒来测定大鼠内皮细胞的蛋白浓度,得出其蛋白浓度的标准曲线方程为y=0.4563x,所提取的大鼠主动脉内皮细胞AGT的蛋白含量在0.0456-0.9126μg/μl范围内。(4)应用western blot法检测转染前和转染后的大鼠主动脉内皮细胞AGT的蛋白表达,图像分析的结果显示,转染pAGT-shRNA1,pAGT-shRNA2,pAGT-shRNA3,pAGT-shRNA4的AGT蛋白表达量分别为(0.11±0.02),(0.12±0.03),(0.14±0.01),(0.14±0.08),与空白对照组(0.58±0.07)和阴性对照组(0.52±0.04)相比,干扰组的AGT蛋白表达受到了明显的抑制(P<0.05),抑制率分别为81.1%、79.3%、75.8%和75.9%。4种不同靶位点的质粒载体所干扰的表达之间无明显差异(P>0.05)。结论:携带AGT基因特异短发夹RNA(shRNA)编码序列的质粒载体pAGT-shRNA可以通过RNA技术特异性抑制大鼠主动脉内皮细胞的AGT基因的表达,为治疗缺血性脑血管疾病提供新的治疗方法。更多还原