柞蚕酚氧化酶原cDNA序列的获得、重组表达及功能研究

【作者】 王夏璐； 郝淋淋； 张嵘；

【机构】 沈阳药科大学；

【摘要】 酚氧化酶原激活系统是昆虫先天性免疫系统中最重要的体液免疫反应之一。酚氧化酶(phenoloxidase,PO)作为该系统的效应酶,能催化形成黑色素,杀死入侵物质,从而起到免疫防御的作用。目前有关PO的研究主要集中在果蝇、斑节虾等生物,对鳞翅目昆虫了解甚少。本文以具有自身免疫特色的中国特有昆虫——柞蚕(Antheraea pernyi)为对象,对其体内的酚氧化酶原(pro phenoloxidase,pPO)进行基因克隆和生物学功能的研究。利用PCR及RACE等分子生物学方法首次获得柞蚕pPO(Ap-pPO)cDNA序列2322bp(Genbank:KJ803014),其中开放阅读框包含2049bp,编码683个氨基酸残基。经预测,Ap-pPO分子量约为78.3kDa,等电点为6.46,无信号肽及糖基化位点。构建大肠杆菌表达体系BL21/pET-28a(+)-Ap-pPO,经分离纯化获得重组Ap-pPO。Western Blot和PO活力测定结果显示,重组pPO不能被SDS,CPC,甲醇,异丙醇非特异性激活剂所激活,能被微量激活的柞蚕血淋巴切割成有活性的形式。经酶学性质研究发现,Ap-pPO的最适pH和最适温度分别为7.8和40℃,且pH值对PO的活力影响较大;PO的特异性底物为焦性没食子酸(Km值为1.81mmol/L)。综上,对Ap-pPO的研究不仅为揭示酚氧化酶原激活系统的激活机制提供物质基础,同时也为昆虫先天性免疫响应的生物多样性提供了理论证据。更多还原