基于RNA-seq的菜薹响应铵硝氮源的研究

【作者】 钟丽华； 宋世威； 刘厚诚； 孙光闻； 陈日远；

【机构】 华南农业大学园艺学院；

【摘要】 利用新一代高通量测序技术从转录组学水平上研究薹菜对不同配比的铵硝氮源的应答响应,有助于揭示不同条件下的氮素代谢通路和分子调控网络,也有助于菜薹相关基因的克隆及遗传研究。将‘油绿501’菜薹采用穴盘育苗,待长到二叶一心时移栽,以2 mmol·L^-1NaNO₃为氮源预培养3 d后,在等氮量条件下设置4个不同铵硝配比处理（对照,0:100;T1,5:95;T2,25:75;T3,50:50）,每个处理设2个生物学重复。每2 d换一次营养液,处理10 d后取菜薹根系样品进行Illumina RNA-Seq测序。利用SOAPdenovo分析软件对获得的高质量序列进行从头组装得到unigene序列。通过与公共数据库Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG比对,进行unigene功能注释。（1）8个菜薹根系样品转录组测序共获得24 Gbp的总数据量,经筛选后共有191 537 584对clean reads,总核酸数为23 942 198 000 nt,其Q20为95.44%。这些reads经过分样品denovo组装后共获得53 746条Unigene,其平均长度为803.16 bp,N50为1 285。其中27.38%的Unigene长度在200²99 nt之间,23.56%在300⁴99 nt之间,22.03%在500⁹99 nt之间,19.50%在1 000¹ 999 nt之间,5.38%在2 000² 999 nt之间,有2.16%长度大3 000 nt。这表明测序和组装质量良好。（2）将Unigene与NR、SwissProt、KEGG和COG数据库进行比对(E value<10^-5),结果共有42 252条Unigene（78.61%）获得注释。被注释的Unigene中有99%（41832）在NR数据库中也得到注释,而在SwissProt、KEGG和COG数据库中分别注释了73.53%（31 070/42 252）,34.63%（14 630/42 252）和34.52%（14 584/42 252）。（3）对42 252条Unigene进行基因功能注释,通过GO注释归类到代谢过程的有13 042个。通过KEGG代谢通路分析将14 630个Unigene分为124类,其中代谢途径通路相关的有3 508个,而氮素代谢通路相关的有108个。COG功能分类将14 584个Unigene归到25个功能类别。（4）利用RPKM法（FDR≤0.005,|log2 Ratio|≥1）分析Unigene在各样本中的表达量,从而获得差异表达基因（DEGs）的信息。各处理的2次重复均有较好的一致性,相关性均在93%以上。最终共得到了2 242个DEGs。根据其在各样本中的表达量,将所有DEG的表达模式归为26个类别,其中11个类别差异显著。后期将分析各途径基因的表达模式,并筛选出关键基因。（5）筛选了12个DEGs,利用qRT-PCR技术检测其在各样本中的相对表达量,并与高通量测序中的RPKM值进行比较,结果大部分基因的表达趋势均一致,验证了本次转录组测序结果可靠。更多还原