花生AhbHLH1参与调控FAD2基因在种子中表达的研究

【作者】 刘玮； 单雷； 唐桂英； 徐平丽； 马小凤； 赵学彬； 谷朝阳；

【机构】 山东省农业科学院生物技术研究中心/山东省作物遗传改良与生理生态重点实验室； 山东大学生命科学学院；

【摘要】 栽培花生是异源四倍体,基因组中包含2个具有功能的FAD2基因(AhFAD2A与AhFAD2B),它们都参与种子中储藏脂不饱和脂肪酸的合成。我们前期研究发现FAD2基因5’UTR区的内含子存在可变剪接现象,不同剪接体具有不同的表达模式,A2和B2主要在发育中后期的种子表达,A4和B4为组成型表达。Kim等(2006,2009)对芝麻FAD2的调控研究中发现,在芝麻种子表达的SebHLH通过与SeFAD2基因启动子-179~53bp区域的E-BOX或G-BOX结合调控其在种子中的表达。我们的研究也发现A2、B2转录起始位点上游200~300bp序列含有多个E-BOX元件,因此以此段序列为诱饵,利用酵母单杂交技术获得了一个与之相互作用的基因克隆,命名为AhbHLH1。qRT-PCR分析发现,该基因主要在种子中表达。为进一步明确该转录因子AhbHLH1与FAD2基因调控区的结合能力与结合位点,我们将AhbHLH1基因克隆到原核表达载体pLM1上,构建重组表达载体pLM1-AhbHLH1,在IPTG诱导下,实现了组氨酸融合蛋白的可溶性表达;并通过优化表达条件(诱导剂浓度、表达时间、温度),采用HisTrap HP层析柱纯化分离得到AhbHLH1蛋白。进一步,以生物素标记包括预测的目标调控区或结合位点区域的双链DNA作为探针,利用EMSA技术分析了AhbHLH1与目标调控区的结合能力与结合位点。EMSA结果表明,AhbHLH1能够与剪接体A2/B2调控区的E-BOX发生结合作用,探针冷竞争反应证明了结合的特异性。初步证明,AhbHLH1通过与FAD2基因启动子区域中E-BOX的结合调控其在种子中的表达。EMSA属于一种体外定性试验,并不考虑体内环境中影响蛋白-DNA结合的因素。我们希望通过后续的染色质免疫沉淀(ChIP)实验,真实、完整地反映AhbHLH1与FAD2基因调控区顺式作用元件的结合,明确AhbHLH1对FAD2基因的表达调控作用,初步探究AhbHLH1在储藏脂中不饱和脂肪酸积累过程中的作用。更多还原