自然海区桡足类肠道食物组成的分子检测方法

【作者】 刘胜； 胡思敏； 郭志灵； 李涛； 林森杰；

【机构】 中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室,中国科学院南海海洋研究所； 中国科学院大学； 海洋生物多样性与全球变化研究中心,厦门大学；

【摘要】 冷水性桡足类是浮游动物的重要类群,了解其自然海区的食物组成对于理解海洋浮游食物网的结构具有重要的意义,但由于研究方法的限制,对于其在自然现场的摄食状况还知之甚少。我们以18S rDNA为目标基因,设计了一套回避桡足类自身及其寄生纤毛虫却能扩增其他真核生物的引物(copepod-excluding eukaryote-common,CEEC),建立了一种基于PCR技术的分子检测方法,可以不依赖于培养实验和肠道解剖而直接检测桡足类在自然现场的肠道食物组成。1、检测了引物的实用性。在中国南海的大亚湾、三亚湾、珠江口及美国东海岸的Avery Point共采集了10属16种桡足类,包括纺锤水蚤属(Acartia)、长足水蚤属(Calanopia)、真哲水蚤属(Eucalanidae)、刺哲水蚤属(Canthocalanus)、隆哲水蚤属(Acrocalanus)、宽水蚤属(Temoridae)、简角水蚤属(Pontellopsis)、歪水蚤属(Tortanus)、拟哲水蚤属(Paracalanus)和胸刺水蚤属(Centropages),发现CEEC可以有效地回避掉上述桡足类及其寄生纤毛虫序列。2、检测了引物对单种真核生物的扩增特异性及涵盖范围。收集了37种不同门类的海洋真核生物,包括硅藻门(8种)、甲藻门(10种)、红藻门(2种)、金藻门(3种)、绿藻门(7种)、管星珊瑚(1种)、箭虫(1种)、自由生活纤毛虫(2种)和软体动物(3种),PCR结果均呈阳性,与GeneBank比对结果显示,所得单种生物的序列与数据库中已报道的相应种属的相似度>99%。3、检测了引物是否可以有效扩增肠道中的混合饵料。对摄食四种混合藻(东海原甲藻Prorocentrum donghaiense、威氏海链藻Thalassiosira weissflogii、三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum和扁藻Tetraselmis suecica)后的红纺锤水蚤(A.erythraea)进行检测,测得的四种饵料藻序列与GeneBnak中相应种类的相似度>99%,且每种藻所占的比例与计数法得到的摄食细胞数的比例基本一致。将该方法运用于珠江口自然现场样品的研究,现场水样生物组成的分子检测结果显示,共发现硅藻6属(47%)、甲藻4属(21%)、后生动物3种(24%)及金藻、隐藻等其他生物(9%),与显微镜检的结果基本对应,虽然两种方法检测到的浮游植物种属组成基本一致,但分子检测结果呈现更高的多样性。以优势种微刺哲水蚤(C.pauper)为目标种,用该方法对其肠道食物组成进行了研究,共检测到6种,包括甲藻(Karenia-like、Karlodinium veneficum)(88%),后生动物(蛇尾Ophionereis reticulata、被囊类Oikopleura),隐藻(Goniomonas sp-like)和放射虫(Acanthostaurus purpurascens),在进化树中,这些门类的生物均与水样中对应的种属聚于同一分支。微刺哲水蚤主要摄食甲藻,占到肠道食物的88%,而水样中硅藻占据优势地位,说明其在自然海区可能存在一定程度的选择性摄食。经过以上单种真核生物—混合饵料—现场水样的PCR扩增效率检测及在桡足类自然现场食物组成研究中的成功运用,证明这种方法可以运用于桡足类在自然海区中的摄食多样性研究。更多还原