miR-203通过调控多环芳烃受体介导TCDD和BaP引起的细胞毒性效应

【作者】 刘彩霞； 李道传； 余皓辉； 曾晓雯； 章征保； 邢秀梅； 陈丽萍； 肖勇梅； 段化伟； 郑玉新； 王庆； 陈雯；

【机构】 中山大学公共卫生学院预防医学系； 中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所；

【摘要】 目的探索microRNA对多环芳烃受体(AhR)介导的多环芳烃及二恶英类物质引起的毒性效应的调控机制,寻找毒性暴露相关的microRNA标志物。方法利用生物信息学检索,预测可能靶向AhR的候选microRNA。构建AhR的全长及各个位点的荧光素酶基因报告质粒,利用双荧光素酶报告实验,筛选出效应显著的microRNA。通过导入microRNA模拟物和microRNA抑制剂检测相应的mRNA及蛋白水平变化,从而确证其靶点效应。再选择合适浓度的AhR配体TCDD以及BaP,观察mir-203以及AhR之间的变化关系。同时通过模拟物以及抑制物的导人干扰内源性miR-203的水平,检测AhR及其下游基因在暴露中对毒物的诱导反应及细胞毒性效应。结果 TargetScan,PicTar等microRNA数据库预测多个可能通过以上方式调控AhR的microRNA,我们选择了其中总体得分最高的5个microRNA——miR-29b/c,miR-124,miR-203和miR-375。经过双荧光素酶报告实验筛选显示,miR-203和miR-124均可结合到AhR mRNA的3’UTR区域(分别是miR-203的第二个结合位点和miR-124相应结合位点),降低荧光素酶的相对活性(31%和32%);AHR mRNA 3’UTR种子区域突变(第二个结合位点)后酶活性恢复,证明了miR-203和miR-124与AHR的结合效应。当在肺腺癌细胞株A549和肝癌细胞株HepG2中导人miR-203和miR-124的模拟物时,可显著降低AhR mRNA(大于20%),和蛋白(大于35%)的表达,并呈剂量-反应关系。利用AhR的经典配体TCDD和BaP处理A549时,可引起miR-203和AhR剂量依赖性的表达增加和降低。而提前转染miR-203模拟物后再用TCDD处理可降低TCDD对下游代谢相关靶基因,如CYP1a1,CYP1a2,NQ01的mRNA诱导程度(41%,36%,37%)。相应的,利用miR-203的抑制物抑制miR-203的表达后,增加了相应基因的诱导表达(1.91-,3.94-,1.86-)。采用细胞增殖实验及CYP1a1酶活性检测,结果表明miR-203的异常表达影响HepG2由BaP处理引起的增殖抑制和CYP1a1酶活性的显著差异(下降15%)。结论 miR-203对AhR的负向调控作用在环境毒物暴露的毒性通路中有着重要的作用。更多还原