流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的方法学探讨

【作者】 陈东亚； 杨明晶； 陆罗定； 俞萍； 徐军； 卞倩；

【机构】 江苏省疾病预防控制中心毒理与功能评价所；

【摘要】 目的探讨利用流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球能力试验万法的灵敏性、稳定性以及易操作性,以期获得一套最优化的方案。方法①不同细胞浓度、微球浓度和孵育时间的摸索:三块六孔板,上排每孔加1 ml制备的腹腔原液,下排每孔加1 ml经Hank液1:1稀释的腹腔液[巨噬细胞数为（1～2）x 10⁸L^-1],每板第1列每孔加经1%BSA预调理的荧光微球1.1 ml,第2列每孔加2.2 ml,第3列每孔加3.3 ml,即微球浓度分别为5×10⁶/孔、1×10⁷/孔和1.5×10⁷/孔。三块板分别于37℃二氧化碳细胞培养箱避光孵育1,1.5和2 h后,弃上清,每次使用2.0 ml 4℃PBS缓冲液轻轻洗涤2次,去上清后再加入4℃PBS缓冲液0.5 ml,用细胞刮刮下贴壁细胞,轻轻吹打均匀后经75μm过滤器过滤后上机分析。②不同消化方法对吞噬率的影响:1块六孔板,腹腔巨噬细胞原液加荧光微球2.2 ml孵育1.5 h,上排每孔加2 ml 0.25%Na₂ EDTA-胰酶消化液,下排每孔加2 ml 0.02%EDTA消化液,37℃消化30 min,收集细胞,常规洗涤后,经75μm过滤器过滤后上机。结果微球浓度越高,吞噬率和吞噬指数越大;细胞浓度为（1～2）×10⁸L^-1,孵育时间1.5 h,微球浓度为1.5×10⁷/孔时吞噬率（PP）和吞噬指数（PI）最高（89.9%,1.54）,孵育至2 h时出现下降（57.7%,1.51）;细胞浓度对吞噬率和吞噬指数的影响与荧光微球浓度呈负相关。贴壁巨噬细胞经胰酶加EDTA消化后PP为44.5%,Pl为0.68,单独使用EDTA消化后PP为37.9%,PI为0.57,均低于使用细胞刮刀处理组。结论将增强免疫力功能评价方法实验条件设置为:巨噬细胞浓度为（1～2）×10⁸L^-1,孵育1 h,1×10⁷/孔微球浓度可使实验快速而又精确的反映巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数,减少人为因素对结果的影响,结果更为客观。更多还原