苯并[a]芘诱导的恶性转化对DNA甲基化转移酶表达水平及活性影响

【作者】 邓雯文； 杨沫； 张遵真； 吴媚；

【机构】 四川大学华西公共卫生学院；

【摘要】 目的研究苯并[a]芘（BaP）诱导的小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化过程对DNA甲基化转移酶（DNMT）表达水平及活性的影响,为进一步阐明BaP致癌的分子机制提供实验依据。方法以野生型小鼠胚胎成纤维细胞(polβ^+/+)和20μmol·L^-1的BaP（经S9活化）长期多次染毒构建的小鼠胚胎成纤维恶性转化细胞（polβ-T）为研究对象,以gadph作为内参,采用RT-PCR检测两种细胞中dnmts（dnmt1,dnmt3a和dnmt3b）的mRNA水平;以15 ku的组蛋白H2AFX为内参,用Western蛋白质印迹方法检测细胞中DNMT（DNMT1,DNMT3a和DNMT3b）的蛋白表达水平,同时用DNA甲基转移酶活性/抑制分析试剂盒检测DNMT的酶活性。结果 polβ-T经转化灶形态观察、细胞迁移实验、软琼脂克隆等实验鉴定,表明polβ-T细胞已具备典型的恶性转化细胞特征。RT-PCR结果显示,polβ-T细胞dnmt1和dnmt3b的mRNA相对表达量分别为0.940±0.033和0.905±0.062,均高于polβ^+/+细胞（0.560±0.031和0.666±0.041）,差异有统计学意义（P<0.05）,两种细胞dnmt3a mRNA相对表达量的差异不明显,无统计学意义;Western蛋白质印迹结果显示,polβ-T细胞DNMT1和DNMT3b的蛋白相对表达量分别为2.172±0.089和1.134±0.144,亦均高于polβ^+/+细胞（1.311±0.050和0.820±0.106）,差异具有统计学意义（P<0.05）,两种细胞DNMT3a的蛋白相对表达水平均无显著性差异;酶活性检测结果显示,polβ-T细胞和polβ^+/+细胞A值分别为1.45±0.08和1.92±0.13,polβ-T细胞中DNMT酶活性[（234±23）mg^-1·h^-1]较polβ^+/+细胞中DNMT酶活性[（318±42）mg^-1·h^-1]明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 BaP可能通过诱导肿瘤相关基因甲基化水平的异常,增加基因组的不稳定性,促进肿瘤的发生发展。更多还原