产肠毒素大肠杆菌黏附素受体结合域的表达及其抗ETEC黏附效果的研究

【作者】 周锐； 王俊； 刘文婷； 徐文俊； 彭健；

【机构】 农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室,农业部猪遗传育种重点开放实验室,华中农业大学动物科技学院动物营养与饲料科学系；

【摘要】 产肠毒素大肠杆菌是引发新生仔猪腹泻的主要病原菌之一。黏附素介导菌体与小肠上皮细胞的黏附,是致病过程中最重要的一步。K88和F18是致仔猪腹泻的两种主要的菌毛类型,FaeG和FedF分别是它们的黏附素。本研究首先利用生物信息学方法预测分析,确定了FedF-1、FedF-2和FaeG-1的功能片段,然后利用pET-SUMO融合表达系统构建融合表达质粒进行诱导表达,并用MALDI-TOF-MS质谱分析其氨基酸序列,最后通过体外黏附和抑制黏附细胞试验来验证五种融合蛋白的抗黏附效果。结果表明:(1)三种融合蛋白的表达量都显著高于总蛋白含量40%。Sumo-FedF-1和Sumo-FedF-1融合蛋白可溶性50%左右,Sumo--FaeG-1三种融合蛋白可溶性高于50%。对三种重组菌株的表达产物进行Western-blotting检测的结果显示三种融合蛋白表达成功。(2)对表达的融合蛋白进行镍亲和层析纯化,摸索了三种融合蛋白的最佳的咪唑洗脱浓度,结果显示三种融合蛋白在300mmol/L的咪唑浓度下洗脱浓度最高。(3)对纯化后的融合蛋白进行MALDI-TOF-MS质谱分析表明,表达的三种融合蛋白氨基酸序列与目的蛋白的氨基酸序列一致。(4)通过抗黏附试验来验证三种融合蛋白的抗黏附效果。结果显示:添加有SUMO-FedF-1融合蛋白的处理组细菌黏附率和对照组相比显著降低(P<0.05),添加有SUMO-FedF-2融合蛋白的处理组细菌黏附率和对照组相比显著降低(P<0.05),但两者之间没有差异。添加有SUMO-FaeG-1融合蛋白的处理组细菌黏附率与对照组相比显著降低(P<0.05)。综上所述,黏附素类似物能够抑制ETEC与肠上皮细胞的黏附,这为预防仔猪腹泻提供新的思路。更多还原