刚地弓形虫绿色荧光蛋白突变株的研究

【作者】 吴亮； 姜旭淦； 傅行礼； 逯兆喜； 涂国华； 李礼； 陈盛霞；

【机构】 江苏大学基础医学与医学技术学院；

【摘要】 目的:构建稳定表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的弓形虫突变株,探讨通过虫体荧光检测宿主细胞感染率的方法。方法:HeLa细胞中培养弓形虫RH株速殖子,待虫体涨破细胞后离心收集虫体,以Cytomix电转缓冲液重悬并调整虫体密度为3.3×107/ml。吸取300μl虫体悬液与50μg去内毒素ptubP30-GFP/sag-CAT质粒充分混匀,电穿孔法(1.5 kV,25μF)向虫体导入质粒,重新接种正常HeLa细胞。培养体系中加入20μM氯霉素12 h后,即可在倒置荧光显微镜下观察到细胞内微弱的绿色荧光;7~10天后,培养瓶内几乎无游离虫体;再继续培养14天后虫体数量明显增多,并可以在HeL,a细胞内稳定传代。以极限稀释法获得稳定表达P30-GFP融合蛋白的荧光突变株,荧光显微镜下可见绿色荧光主要集中于虫体外膜。在普通光学显微镜下,HeLa细胞内"纳虫泡"不明显,而荧光下则可清晰地观察到虫体在细胞内形成的"纳虫泡"。不同数量荧光突变株感染HeLa细胞,24 h后荧光显微镜下计数具有绿色荧光"纳虫泡"的HeLa细胞数量;以胰酶消化收集细胞,通过流式细胞仪计数荧光"纳虫泡"的比率。结果:HeLa细胞感染率随接种荧光突变株数量的增加而增多。荧光显微镜计数简便易行,流式细胞仪则可以获得精确的细胞感染率。结论:GFP荧光突变株为检测虫体在宿主细胞内增殖提供了新途径。更多还原