高温胁迫下菜薹SSH文库的建立

【作者】 郭培国； 夏岩石； 曾娴娴； 李荣华； 许兰桂； 黄红弟； 郑岩松； 李光光； 张华；

【机构】 广州大学生命科学学院； 广州市农业科学研究院；

【摘要】 菜薹(Brassica campestris L.ssp.chinensis var.utilis Tsen et Lee)又称菜心,是华南地区种植面积最大的主要蔬菜作物之一。盛夏秋初的高温胁迫严重影响菜薹的正常生长与发育,导致菜薹产量及品质下降。了解菜薹耐热和适应高温机理可为耐高温菜薹品种的选育提供指导。已有研究报道了高温热胁迫对菜薹的一些生理特性和形态性状的影响,这些研究结果有利于认识菜薹的耐热生理机理。而发现和分析在耐热性上具有明显差异的菜薹材料在高温胁迫下的差异表达基因,一方面可了解菜薹耐热的分子机理、进一步认识和了解菜薹的高温适应性机理,另外还可开发出具耐热基因信息的功能分子标记,辅助耐热菜薹品种的选育。目前鲜见这方面的研究报道。因此,探讨和发现耐热性强和耐热性弱菜薹材料在高温胁迫下差异表达的基因是一项有意义的研究工作。供试的菜薹材料‘四九19号菜心’(耐热性强)和‘3T6’(耐热性弱)由广州市农业科学研究院提供。种子盆栽置于温室,待长至2叶1心后转移至人工气候箱中,在5叶期实施高温胁迫处理。胁迫处理1 d后收取叶片,提取叶组织的总RNA,运用试剂盒对两菜薹材料进行抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH);利用pGEM-T easy作载体,蓝白斑筛选的方法,建立耐热性强和耐热性弱的两菜薹材料间的SSH文库。利用菌落PCR检测文库中各个插入cDNA片段大小,采用Sanger测序方法测定文库各个cDNA的序列;利用NCBI数据库,采用BLAST方法对测定的序列进行序列比对和功能注释。建立的以‘四九19号菜心’为Tester、‘3T6’为driver的SSH文库中含有160个阳性克隆,菌落PCR表明其中154个克隆的PCR扩增产物为单一条带,且其扩增产物在400~680 bp之间;有2个克隆未能扩增出特有的PCR条带,4个克隆扩增产物为2个或以上条带。154个单一条带克隆的序列被分析,采用DNAStar软件去除接头序列和载体序列,cDNA序列的平均长度为344 bp;对所有154个EST序列进行拼接分析,组装出98个unique sequences(其中22个contigs,68个singletons);Blast分析结果显示其中9个uniques在NCBI基因库中未找到类似的序列,其他的89个具有高度相似的基因序列及功能注释。有功能注释的基因主要涉及参与植物逆境防御和保护反应、信号传导、蛋白质合成和光合作用等活动。这些在高温胁迫下在‘四九19号菜心’中大量表达的基因可能与菜薹的耐热性相关,进一步分析这些基因功能和表达模式可服务于解析菜薹耐热性分子机理和高温的适应性。更多还原