放射受体显像剂-人tumstatin的克隆表达及其鉴定

【作者】 宋娜玲； 贺欣； 王德芝； 张春明； 颜廷东； 温镭； 赵启仁；

【机构】 中国医学科学院放射医学研究所 天津分子核医学重点实验室；

【摘要】 目的:人肿瘤抑素（tumstatin）可以抑制肿瘤新生血管的生成,通过用⁹⁹Tc^m标记tumstatin,进行肿瘤的放射受体显像,具有重要和潜在的临床应用价值。克隆tumstatin基因,重组表达tumstatin蛋白,为人tumstatin的肿瘤放射受体显像奠定基础。方法:从HEK293细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增tumstatincDNA,导入克隆载体pMD19-T,再转化E.coli DH5α,挑选阳性克隆,测定基因序列。然后双酶切克隆载体目的基因,插入原核表达载体pET28a中,转化E.coli BL21（DE3）,IPTG诱导重组蛋白的表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析,western blot进行鉴定,通过MTT法检测tumstatin对卵巢癌细胞系ES-2增殖的影响。结果:提取的RNA经电泳有明显的28S,18S,5S三条带,且28S,18S亮度之比约为2:1。RT-PCR扩增产物经琼脂糖电泳与理论值750bp相一致。酶切鉴定和DNA测序证实tumstatin基因正确地插入表达载体中,序列100%正确。重组tumstatin在大肠杆菌中获得高效表达,其分子量约为29kD,表达量约占菌体总蛋白量的30%。通过MTT实验,证实了其具有抑制肿瘤细胞生长的生物学活性。结论:tumstatin基因原核表达载体成功的构建和重组人tumstatin蛋白在大肠杆菌中的高效表达,为进一步的tumstatin的放射受体显像奠定基础。更多还原