大豆茎干蛋白质组学研究体系的构建

【作者】 刘卫国； 邹俊林； 罗玲； 杨晨雨； 刘春燕； 杨峰； 杜俊波； 杨文钰；

【机构】 四川农业大学农学院/农业部西南作物生理生态与耕作重点实验室；

【摘要】 【研究背景】如何利用分子生物学的手段,揭示大豆茎干形态建成的机理及其受光照、水肥条件等环境因素影响的内在机制,是进行一步提高大豆产量的基础。大豆茎干质地坚硬,木质素和纤维素等非蛋白成分含量高,功能蛋白含量低,蛋白的提取、分离难度大,目前还没有一套完整、可行的双向电泳技术。因此,要获得高质量、可重复的双向电泳图较为困难,影响了从蛋白质组学水平研究大豆茎干形态建成及其对环境响应的分子机理方面的工作进程。【材料与方法】本研究选取茎干生长特性具有代表性的栽培大豆3份和野生大豆1份,其中栽培大豆茎干生长类型包括无限生长型、亚有限生长型和有限生长型三种类型各1份。对双向电泳的蛋白提取、上样量、PG胶条选择、SDP-PAGE胶浓度、染色方法等进行了筛选和优化。并对不同生长习性大豆茎干的蛋白组进行对比分析,找到共同表达的蛋白点,用MALDI-TOF MS/MS质谱对其进行分析、生物信息学的方法对其蛋白进行了功能注释和分类,最终建立大豆茎干蛋白质组参考图谱。【结果与分析】蛋白提取,TCA/丙酮法虽然可以增加蛋白的溶解性,但与酚法的2D-PAGE相比,背景色较深,蛋白点(特别是酸性和碱性端)纵向拖尾较重,不能完全分离;而酚法的背景浅,但蛋白点少,丢失严重;采用TCA/丙酮法与酚法相结合的新方法,蛋白点没有显著减少,胶面纵条纹消失,蛋白点的分离效果好;上样量800μg、pH3.0-10非线性IPG胶条、10%SDS-PAGE胶分离、考染,对各种类型的大豆茎干蛋白均能很好的分离,蛋白点清晰,蛋白分离好,点多,背景浅;不同生长习性大豆对茎干蛋白点进行聚类分析明表,三个栽培大豆能够完全聚为一类,而野生大豆与栽培大豆的距离较远,这与其茎干的实际形态相符;应用三个栽培大豆,获得了包含341个共有蛋白点的大豆茎干双向电泳参考图,对其中的169个蛋白点获得了质谱鉴定和功能分类,可将其分为23个功能群。在生物学过程分类中,参与代谢过程的蛋白点最丰富,占所有鉴定蛋白点的29%,其中又以参与碳水化合物代谢的蛋白最多,他分属42个蛋白点的29个不同蛋白;其次是与细胞过程(cellular process)有关的蛋白,此过程包括前体物质生成代谢,能量代谢,细胞蛋白代谢,细胞氮化物代谢,细胞高分子化合代谢,细胞成物合成过程,细胞调节和细胞死亡与循环等。【结论】本研究获得的大豆蛋白茎干双向电泳研究方法和不同生长习性大豆茎干蛋白质组参考图谱,为进一步利用蛋白质组学研究大豆茎干功能、生长发育规律及其与环境间的互作奠定了基础。更多还原