高三尖杉酯碱联合阿克拉霉素协同诱导急性髓细胞白血病细胞凋亡的分子机制

【作者】 金洁； 王蕾；

【机构】 浙江大学医学院附属第一医院血液科；

【摘要】 目的探讨高三尖杉酯碱联合阿克拉霉素协同杀伤急性髓细胞白血病细胞的分子机制,为AML靶向联合治疗方案的设计提供实验依据。方法采用表达谱芯片筛选对照组、HHT单药组、ACR单药组、HHT联合ACR组THP-1细胞差异表达的基因。Real-Time PCR检测目的基因m RNA表达水平对芯片结果进行验证。Western Blot检测Caspase家族蛋白、Bcl-2家族蛋白表达变化、WNT通路关键蛋白、PI3K/AKT通路关键蛋白表达变化。为进一步验证靶向抑制WNT3a及AKT后能否模拟HHT与ACR对THP-1细胞的协同杀伤作用,我们采用脂质体转染技术转染WNT3a的siRNA干扰片段以沉默THP-1细胞WNT3a基因。再分别采用MTT法及流式细胞术Annexin V/PI双染色法检测WNT3a干扰后联合HHT或AKT抑制剂后对THP-1细胞生长抑制及诱导凋亡作用,并与未干扰WNT3a的THP-1细胞进行比较。进一步我们采用GSK-3β抑制剂上调THP-1细胞β-catenin表达,观察是否能逆转HHT联合ACR对THP-1细胞的生长抑制及诱导凋亡作用。结果 (1)芯片筛选结果发现90nMACR及联合HHT和ACR作用THP-1细胞3h后WNT信号通路中的关键基因表达发生改变,而在HHT组较少WNT通路的基因表达发生改变。其中WNT1基因、WNT3A基因、β-catenin基因(CTNNB)、GSK-3β基因在HHT组与ACR组和联合用药组中的表达存在差异。(2)定量PCR结果也证实36nMHHT作用THP-1细胞和Kasumi细胞1h后WNT3A基因mRNA表达先上调随后回落至用药前水平,而90nMACR作用THP-1细胞和Kasumi细胞1h-12h后WNT3A基因mRNA表达明显下调,联合HHT和ACR作用3h-12h后WNT3A基因mRNA表达也明显下调。β-catenin基因mRNA表达变化也呈类似结果。HHT、ACR、HHT联合ACR作用THP-1、Kasumi细胞1h-12h后GSK-3β基因mRNA表达变化无明显规律。(3)实验浓度HHT及ACR单独作用均可激活Caspase9、Caspase3并引起PARP剪切。HHT联合ACR可更明显激活Caspase9、Caspase3及PARP。(4)实验浓度HHT及ACR单独作用THP-1细胞和Kasumi细胞均可下调Bcl-xl、Mcl-1蛋白并上调Bax蛋白。但HHT对两者Bcl-2蛋白表达无明显影响,而ACR可明显下调Bcl-2蛋白。(5)36nMHHT作用3h-24h后对THP-1细胞和Kasumi细胞WNT3a蛋白表达无明显影响,但作用3h即可明显下调PI3K110、P-AKT和β-catenin蛋白并上调GSK-3β蛋白。90nM ACR作用两种AML细胞株细胞3h后即明显下调WNT3a蛋白表达及β-catenin蛋白,但对PI3K110、P-AKT及GSK-3β蛋白表达无明显影响。36nMHHT联合90nMACR可同时抑制THP-1细胞、Kasumi细胞WNT3a、β-catenin、PI3K110及P-AKT蛋白表达。(6)沉默THP-1细胞WNT3a基因后再联合HHT或AKT抑制剂能增加HHT及AKT抑制剂对THP-1细胞的生长抑制及诱导凋亡作用。一定浓度比联合AKT抑制剂与ACR亦能协同抑制THP-1细胞生长并协同诱导其发生凋亡。(7)采用GSK-3β抑制剂部分上调THP-1细胞β-catenin后能部分逆转实验浓度HHT联合ACR对THP-1细胞的生长抑制作用,但对HHT、ACR单药引起的生长抑制作用无明显改善。GSK-3β抑制剂作用对HHT、ACR、HHT联合ACR对THP-1细胞的诱导凋亡作用无明显逆转。结论 HHT可能通过抑制AML细胞的PI3K/AKT活性而抑制其生长并诱导凋亡。ACR可能通过抑制AML细胞的WNT/β-catenin通路活性而抑制其生长并诱导凋亡。HHT联合ACR可能通过同时抑制PI3K/AKT通路及WNT/β-catenin通路而发挥协同杀伤AML细胞的效应。β-catenin作为上述两条信号通路的共同作用分子可能是HHT与ACR协同杀伤AML细胞的分子靶点之一。的生长抑制作用无明显改善。GSK-3β抑制剂作用对HHT、ACR、HHT联合ACR对THP-1细胞的诱导凋亡作用无明显逆转。结论 HHT可能通过抑制AML细胞的PI3K/AKT活性而抑制其生长并诱导凋亡。ACR可能通过抑制AML细胞的WNT/β-catenin通路活性而抑制其生长并诱导凋亡。HHT联合ACR可能通过同时抑制PI3K/AKT通路及WNT/β-catenin通路而发挥协同杀伤AML细胞的效应。β-catenin作为上述两条信号通路的共同作用分子可能是HHT与ACR协同杀伤AML细胞的分子靶点之一。更多还原