间接ELISA鉴别诊断自然感染与免疫接种鸡群禽流感病毒抗体

【作者】 王琰； 孙建和； 陆承平； 严亚贤； 刘佩红； 王建； 周锦萍；

【机构】 上海交通大学农业与生物学院； 南京农业大学动物医学院； 上海市畜牧兽医站；

【摘要】 【目的】通过间接ELISA,在群体水平上,鉴别诊断自然感染与免疫接种鸡群禽流感病毒抗体。【方法】通过套式RT-PCR扩增,获得H9N2型禽流感病毒NS1蛋白的编码DNA。将所得的编码DNA插入pET-32a(+),构建出能够表达NS1蛋白的重组表达载体。将该载体导入到大肠杆菌BL21细胞中,在适当温度和IPTG诱导下表达,采用SDS-PAGE电泳和WesternBlot鉴定所表达的蛋白,并对重组蛋白进行纯化。利用纯化的重组禽流感NS1蛋白作为抗原建立间接ELISA,测定反应的最佳条件。用已建立的间接ELISA,检测禽流感H9N2活毒感染、灭活疫苗免疫的鸡群中的NS1抗体水平,确定ELISA阴、阳性临界值,以及鸡群的最少检测样本数,以鉴别诊断整个鸡群是否感染禽流感野毒。【结果】试验所得重组表达产物为46000的禽流感病毒NS1融合蛋白。表达产物经纯化后,获得1-3mg/mL禽流感病毒NS1融合蛋白。所建立的ELISA,NS1抗原的最佳包被浓度为40μg/mL,抗体的最佳稀释倍数为1:200,酶标二抗的最佳稀释倍数是1:10000,抗原抗体最佳反应时间均为1h,ELISA检测结果经统计学分析,H9N2灭活疫苗接种组与非免疫鸡的自然阴性血清、禽流感H9N2病毒感染组血清p<0.05,差异显著,确定ELISA阴阳性判定的OD临界值为0.5;检测鸡群血清样本数至少为30份。【结论】本方法可用于鉴别禽流感野毒感染。更多还原