哈维氏弧菌谷胱甘肽硫转移、过氧化物酶的克隆与免疫作用研究

【作者】 王海洋； 丁燏； 鲁义善； 简纪常； 吴灶和；

【机构】 广东海洋大学水产学院； 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室； 广东省水产经济动物病害控制重点实验室； 仲恺农业工程学院；

【摘要】 本研究通过同源引物从实验室保存的哈维氏弧菌基因组扩增得到了GPx和GST基因,将两个基因分别克隆至pMD-18T载体测序,并进行生物信息学分析。GPx基因全长546bp,含有完整的ORF,编码182个氨基酸组成的蛋白质。氨基酸序列经过Blast对比,与霍乱弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌的序列相似性高达97-99%。GST基因全长618bp,含有完整的ORF,编码206个氨基酸组成的蛋白质。氨基酸序列经过Blast对比,与霍乱弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌的序列相似性为96-98%。将两个基因分别亚克隆到原核表达载体pET-28a(+),构建原核表达质粒pET-GPx和pET-GST,且在大肠杆菌BL21(DE3)中获得大量表达。其中GPx在37℃,4小时,IPTG浓度0.8mmol/L表达量达到最高;GST在37℃,5小时,IPTG浓度1.0 mmol/L表达量达到最高。通过镍亲和层析完成GPx、GST的分离纯化。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,纯化的蛋白为单一条带,分子量分别为17kDa和25kDa。将纯化的重组GPx、GST蛋白,通过腹腔注射的方式免疫斜带石斑鱼,4周后用致病性哈维氏弧菌进行人工感染试验,对斜带石斑鱼的免疫保护率分别为85%、80%。表明其具有免疫保护效应。更多还原