虹鳟抗菌肽制备与应用关键技术研究

【作者】 罗琳； 马志宏； 李铁梁； 姜娜； 邢薇； 李文通； 苏建通；

【机构】 北京市水产科学研究所；

【摘要】 依据假想虹鳟Hepcidin的部分CDS序列设计引物,进而利用RACE PCR、拼接等方法得到虹鳟抗菌肽Hepcidin cDNA全长序列。针对毕赤酵母表达系统的特点,对hepcidin基因进行稀有密码子的优化,目的基因hepcidin在毕赤酵母中的差异性由最初的46.88%优化到34.89%。构建了hepcidin基因的不同的重组毕赤酵母真核表达载体,2种表达载体分别为pGAPZαA(组成型)、pPICZαA(诱导型),4种重组质粒分别为pGAPZαA/pPICZαA-hep及pGAPZαA/pPICZαA-mhep,分别电转化到毕赤酵母GS115(Mut+型)、KM71H(Muts型)2种宿主细胞中,获得重组毕赤酵母菌株。重组酵母菌株能检测到目的多肽的表达、且具有抑菌活性:对获得的重组毕赤酵母菌株进行培养表达,得到的表达多肽对多种细菌具有较强的抑菌活性。表达多肽均对大肠杆菌标准株1.2385、金黄色葡萄球菌标准株1.2386、副溶血弧菌1.2164、维氏气单胞菌X-1-06909、嗜水气单胞菌HA-336、维氏气单胞菌CL0901抑菌活性较强,且抑制率最高可以达到92.7%。72h诱导、2层纱布包瓶口最有助于表达目的多肽:对重组菌株KM71H/pPICZαA-mhep-10、11、12、16的诱导表达条件进行了优化实验,当诱导时间为72 h、采用2层纱布覆盖摇瓶瓶口时,表达多肽具有较好的抑菌效果。利用100L全自动发酵罐对抗菌肽的中试生产工艺进行研究后,使用含抗菌肽的酵母上清液对虹鳟抗细菌病能力的影响:在基础料中添加2.5%、5%和10%自制抗菌肽溶液以及200mg/kg(推荐用量)的天蚕素配制成4种等氮等能的实验饲料,另设一专喂基础料的对照组。在投喂实验结束后用鳗弧菌(Vibrio anguillarum)进行攻毒实验。实验结果表明,本项目研制的抗菌肽添加剂对虹鳟的生长无明显不良影响;能明显提高虹鳟对致病菌的抗病力;综合实验结果考虑,本项目研制的抗菌肽添加剂在虹鳟饲料中的添加量以5%-10%为宜。更多还原