农杆菌介导的大豆水培法转化系统的建立

【作者】 沈娟； 裴孝伯； 喻德跃； 陈全战； 贲爱玲； 续晨； 蔡小宁；

【机构】 南京晓庄学院； 安徽农业大学； 南京农业大学；

【摘要】 目前应用于大豆遗传转化的方法主要有基因枪法、根癌农杆菌介导法、花粉管导人法和真空抽滤法等,农杆菌介导法具有经济、操作简单、可以完整地将DNA以单拷贝或低拷贝的形式插入到受体基因组中等优点,是大豆转基因的一种最常用的方法,但是具有较强的基因依赖性,往往获得的转基因植株生根困难,而导致试验失败。因此,我们通过本试验建立了一种农杆菌介导的大豆水培法转化系统,其基本操作过程为:1)大豆种子消毒及萌发:挑选饱满健康的大豆种子于已灭菌容器中,70%乙醇浸泡大豆种子几十秒,0.1%升汞浸泡8 min(或84液浸泡8 min),无菌水冲洗3～4次。在超净工作台上将消毒后的大豆种子播种于固体培养基M上发芽,于25—28℃环境下光照培养5～7d。2)农杆菌侵染外植体及共培养:农杆菌菌株为LBA4404,植物表达载体为pBll21。将无杂菌污染的萌发转绿的大豆沿两片子叶中间纵切子叶节,切去顶芽和侧芽,在叶腋处纵向划6～8刀伤口,备用,农杆菌液中浸泡30 min,取出,用滤纸吸去多余菌液,转入液体共培养基G中,弱光或黑暗环境,25℃温度下共培养3 d,期间注意保湿。3)转化体的抗性筛选:将共培养后的大豆外植体转入液体筛选培养基Y,诱导抗性芽发生,2周后,转入液体培养基S中生根,1～2周后,将已经生根的抗性苗移栽到土壤中继续生长。1个月以后取叶片进行GUS检测,对GUS检测染色为蓝色的植株取叶片提取DNA。4)转化体的分子检测:选取GUS染色变蓝的22株大豆植株进行PCR检测,其中:16株扩增出明显的条带,2株扩增出的条带不明显,4株未扩增出条带。更多还原