应用LAMP技术检测人偏肺病毒方法的建立

【作者】 宋秦伟； 朱汝南； 钱渊； 赵林清； 邓洁； 孙宇； 王芳； 丁雅馨；

【机构】 首都儿科研究所病毒研究室；

【摘要】 目的运用逆转录-环介导等温扩增技术(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)建立一种简捷、敏感、特异的人偏肺病毒(Human metapneumovirus,hMPV)检测及分型方法。方法 LAMP技术是利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)和能够识别6个靶序列区域的4条特异性设计的引物,在恒温条件下完成靶基因的高效扩增,并且凭肉眼即可判断出检测结果。通过Primer Ex-plorer V4在线软件,针对A、B两个亚型hMPV的M蛋白编码基因,分别设计合成LAMP引物,建立A和B两个亚型hMPV的RT-LAMP检测方法。验证该方法的特异性并确定其检测灵敏度下限。通过对本所附属儿童医院收集的急性呼吸道感染患儿的咽拭子和鼻咽分泌物共115份临床标本进行RT-LAMP方法检测并和本实验室已建立的普通RT-PCR方法和Real-time PCR方法的检测结果进行比较。结果检测反应可在63℃恒温条件下,60 min完成。反应结束后可根据是否产生白色混浊沉淀进行判断,有白色浑浊沉淀产生的为阳性,无沉淀生成的为阴性。为了使反应结果更易于肉眼判断,可向反应体系中加入荧光目视检测试剂(FD),反应结束后,在日光灯下观察,淡绿色为阳性,橙红色为阴性;如在紫外灯下观察,明亮的荧光绿为阳性,淡绿色为阴性。检测上述其他常见呼吸道病毒没有非特异性扩增,即无交叉反应。检测hMPV-A和B的灵敏度均达到5个拷贝/μl。对115份临床标本的检测结果显示,RT-LAMP方法检出A型21份,B型42份,A和B双阳2份;RT-PCR方法检出A型23份,B型33份;Real-time PCR方法检出A型19份,B型34份。RT-LAMP方法与RT-PCR和Real-time PCR方法检测结果的符合率均分别为95.2%(219/230)和95.7%(220/230),经统计学分析,一致性好,但是相比较RT-PCR和Real-time PCR,本方法更为简便、快速。结论 RT-LAMP方法作为一项新的快速核酸检测技术,检测并鉴别A、B亚型hMPV具有简便、敏感、特异的优点;检测反应可在63℃水浴中,60 min完成,并仅凭肉眼即可判断出结果,适合在不同条件的医疗单位和疾控部门推广。更多还原