转录因子Ets-1对ORMDL3基因的表达调控作用

【作者】 高珊； 周国平； 金蕊； 庄丽丽； 袁文霄； 蒋莉； 朱亮华； 邱灵芝； 李悦；

【机构】 南京医科大学第一附属医院儿科；

【摘要】 目的血清类粘蛋白1样蛋白3(ORMDL3)基因是2007年通过全基因组关联研究确定的迄今为止与哮喘关联最有充分证据的基因。有研究表明,哮喘和反复喘息患儿外周血ORMDL3的mRNA表达增高,但调控其表达改变的分子机制目前不明确。本研究通过克隆ORMDL3基因启动子并寻找其最小活性区域和鉴定调控ORMDL3基因的关键转录因子,为阐明其转录调控机制奠定基础。方法采用5′端cDNA末端快速扩增法(rapid amplification of cDNA ends,RACE)确定ORMDL3基因的转录起始位点。以HEK-293细胞基因组DNA为模板,采用PCR方法获取ORMDL3基因5′侧翼序列及一系列5′端缺失体,定向插入pGL3-Basic载体。运用双萤光素酶报告基因检测系统鉴定其启动子活性并确定启动子最小活性区域。利用点突变技术、RNA干扰、转录因子过表达、染色质免疫沉淀实验,鉴定调控ORMDL3基因的关键转录因子。结果 5′-RACE实验发现ORMDL3基因具有多个转录起始位点,它们位于翻译起始密码子ATG上游34到143 bp位。将构建的ORMDL3基因5′侧翼序列(pGL-1318/+58)及一系列截短片段的重组报告质粒转染入细胞,萤光素酶活性分析结果显示:从-1316 bp缺失到-84 bp位后,仍具有较高的启动子活性,但当缺失到-8 bp位时,基本与阴性对照质粒pGL3-Basic活性相当,提示ORMDL3启动子最小活性区域位于-84～+58 bp区域,而且在-84～-9 bp区域之间存在重要的调控元件。生物信息学预测该区域包含了Ets-1,SRY,p30和CREB等转录因子结合位点,点突变、RNA干扰、转录因子过表达、染色质免疫沉淀实验结果表明Ets-1能与ORMDL3的启动子区结合并正向调控ORMDL3的表达。结论 ORMDL3启动子最小活性区域位于-84～+58 bp区域,,Ets-1是调控ORMDL3基因启动子活性的关键转录因子。许多参与气道炎症和气道重塑过程的基因的表达受Ets-1的调控,我们的研究发现,Ets-1亦能调控哮喘易感基因ORMDL3的表达,这为Ets-1调控的靶基因家族增添的一个新的成员,同时也为证实Ets-1在哮喘发病机制中的作用提供了新的信息。更多还原