口蹄疫病毒3AB克隆表达及其抗体间接ELISA检测方法建立与应用研究

【作者】 朱文钏； 孔繁德； 林祥梅； 徐淑菲； 吴德峰； 韩雪清； 吴绍强；

【机构】 厦门出入境检验检疫局； 福建农林大学动物科学学院； 中国检验检疫科学研究院动物检疫实验室；

【摘要】 本研究根据口蹄疫基因结构采用重叠PCR方法人工合成口蹄疫3AB全基因片段,将其克隆到PET-28a+表达载体,经诱导转化导入工程菌BL21(DE3)中,经鉴定该菌成功表达了口蹄疫3AB蛋白,获得大小约为33Ku的重组表达蛋白。以纯化的重组表达蛋白为抗原,经过包被浓度、特异性和反应条件等一系列条件的优化,建立了用于检测口蹄疫3AB蛋白抗体的的ELISA检测方法 ,选择0.625mg/L作为最佳抗原包被浓度;血清最佳稀释度为1:100,最佳作用时间为45 min;酶标二抗羊抗猪IgG-HRP最佳工作浓度为1:25000,最佳作用时间为45 min;最佳封闭液为含0.5%酪蛋白的PBS,最佳稀释液为含0.5%酪蛋白的PBST;最佳底物作用时间为10 min。用同一批重组3AB蛋白包被的ELISA板对6份样品进行检测,每份重复5孔,结果显示,重复性试验变异系数的均值为5.314,其中最大的为11.702,表明该方法具有良好的重复性。用同一批次包被的酶标板采用不同干燥方法 (包括37℃2 h、37℃4 h和真空抽干),分别间隔1个月、2个月、3个月进行ELISA检测,结果显示,3种干燥方法中以真空抽干效果最好,随时间延长,OD值差异较小,且P/N值较大,说明具有较好的稳定性,因此选择真空干燥作为最佳干燥方法。同时将建立的方法用于检测口蹄疫疫苗免疫猪血清、猪瘟病毒(HCV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)和猪细小病病毒(PPV)阳性血清,均显示阴性,说明建立的方法特异性良好。根据血清样品抗体效价=(OD样品-OD阴性)/(OD阳性-OD阴性)来确定判定标准,根据公式计算得到样品效价小于0.30判为阴性,介于0.30与0.49之间判为弱阳性,大于0.49判为强阳性。将建立的方法与进口口蹄疫非结构蛋白3ABC阻断ELISA试剂盒进行比较,对56份猪血清分别用已建立的3AB-ELISA检测方法和PRIONICS公司的FMDV 3ABC抗体阻断ELISA检测试剂盒进行检测,结果本研究建立的ELISA检测结果有3份强阳性、2份弱阳性,其余51份为阴性,阳性率为8.93%;PRIONICS公司的试剂盒检测结果为3份强阳性、3份弱阳性,50份阴性,阳性率为10.71%。二者符合率为98.21%。结果显示,本研究建立的口蹄疫3AB蛋白抗体ELISA检测方法可以用于区分猪口蹄疫自然感染与疫苗免疫动物。更多还原