扫描电镜超微结构观察鉴定蛇舌状虫属(Armillifer spp.)若虫与基于其18SrRNA基因的种系发育关系分析

【作者】 李健； 石云良； 施维； 方芳； 周庆安； 李雯雯； 何国声； 黄维义；

【机构】 广西大学动物科学技术学院； 中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点实验室；

【摘要】 目的运用扫描电镜超微结构观察以鉴定食蟹猴体内分离的蛇舌状虫若虫,并基于18SrRNA序列分析其分子种系发育关系。材料方法将保存于70%酒精中的若虫应用常规的戊二醛与锇酸双固定法,置于扫描电镜下观察。消化样品,提取全基因组DNA,对18SrRNA基因进行扩增并测序;运用序列比对软件ClustalX 1.83将测序结果与相关序列进行多重比对分析,用MEGA 4.0采用邻位相连法构建种系发育树进行分析。结果若虫呈圆柱状,前段略粗,末端变细,呈纺锤形。前段腹环上下距离逐渐增宽,至12～13腹环时趋于等宽,腹环与腹环之间,在前半段连接紧密,在后半段有一定间隔。头部腹面正中为口呈圆形,口稍上方两侧各见一对钩,钩几乎在同一平行线上。两外侧钩正下方,头胸部最后一节胸环上各有一个对称的大型感觉乳突,紧接的第一节腹环靠中线处有一对对称的大型感觉乳突,腹环数目由此算起共29个腹环,末端有2个腹面未连接的不完整腹环不计算在内。若虫全身布满近圆形的感觉乳突,但在头部背面与末节腹面未见有这样的乳突出现。末端腹面有一块状隆起上可见肛门开口。大部分形态特征与串珠蛇舌状虫(Armillifer moniliformis)相似。扩增得到长度为1836bps的18SrRNA基因序列,经测序后采用邻位对接法构建的种系发育树,表明A.moniliforrmis与A.agkistrodontis、A.armillatus构成自展值为95%的分支,前二者又构成一个独立的自展值为75%的分支。此次分离食蟹猴的蛇舌状虫若虫暂鉴定为串珠蛇舌状虫若虫。讨论根据此次分离到蛇舌状虫若虫的地域分布暂将其定为A.moniliformis。扫描电镜观察此次分离的若虫的体表特征,将其与之前张永年等报道的A.agkistrodontis若虫相比有明显不同,较Banaja报道的L.serrata若虫存在更为显著差异。值得一提的是该若虫腹环后缘形成的"锯齿样"饰物与L.serrata若虫腹环后缘的单行细刺是不一样的。以上的观察将为我国对A.moniliformis若虫虫种的鉴定及药物治疗等方面的研究提供基础资料。分子种系进化关系方面,本文的结果与Tappe等基于A.armillatus的18SrRNA基因序列构建种系发育树关于舌形虫与其宿主间协同进化的结论吻合,而且同处于亚洲分布的A.moniliformis、A.agkistrodontis两个种独立于非洲分布的A.armillatus能形成一个自展值为75%的拓扑分支,暗示着依据地域分布鉴定虫种的合理性。此次种系发育分析结果已足以在分子上区别于该虫与之前造成错误鉴定的L.serrata、P.crotali,为今后A.moniliformis若虫所致的人舌形虫病提供了分子诊断的可能。更多还原