微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

【作者】 刁玉梅； 宫鹏涛； 李建华； 苏利波； 杨举； 李赫； 张国才； 张西臣；

【机构】 吉林大学畜牧兽医学院；

【摘要】 根据GenBank中CSpV S-dsRNA基因序列(登录号为EU183404),采用Primer 5.0软件设计特异性引物,从C.parvum总RNA中扩增出S-dsRNA基因,并进行原核表达及蛋白纯化;然后以纯化的重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,进行脾细胞和骨髓淋巴细胞的融合,筛选阳性杂交瘤细胞株后进行单克隆抗体的大量制备和纯化;最后将单克隆抗体进行辣根过氧化物酶标记,建立微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白双抗夹心ELISA。结果显示:扩增出了960 bp的CSpV衣壳蛋白基因开放阅读框,与GenBank公布的S-dsRNA基因序列(登录号为EU183404)进行比对,同源性为98.75%。重组蛋白在37℃下经1 mmol/L IPTG诱导4 h,表达量最大,主要以包涵体形式表达,相对分子质量约为37 kDa,表达量占蛋白总量的72.6%。Western botting重组蛋白具有反应原性。筛选出2株能稳定分泌抗重组蛋白的杂交瘤细胞株1A9和23A7,单抗亚类分别为IgG1和IgG3。Westernblotting表明1A9和23A7可识别重组病毒衣壳蛋白,间接免疫荧光实验表明1.A9可识别C.parvum子孢子顶端部分。双抗夹心ELISA方法的最佳检测条件,抗体最佳工作浓度为1:200,酶标抗体的最佳工作浓度为1:800,最佳封闭剂为1%BSA。最低检测量为每克粪样含25个卵囊,灵敏度较高;与牛安氏隐孢子虫粪样没有交叉反应,特异性较强;与镜检符合率为100%。本研究为隐孢子虫的鉴定与人隐孢子虫病的诊断提供方法基础。更多还原